微藻酶的潜在生物技术应用

高保燕，于博涵，张 虎，方云明，张成武

(1. 暨南大学 生命科学技术学院 生态学系 水生生物研究中心，广东 广州 510632；2.北京化工大学 化工系 生物炼制国家能源研发中心，北京 100029)

微藻是一类形态大小各异、能利用太阳能、固定CO2、吸收无机营养盐转化为有机物的光合低等生物，它们分布于各种生境，如淡水、咸水、海水以及潮湿的土壤或岩石表面，一些嗜极端环境的微藻可生活于高温温泉、雪地、冰川，甚至酸性、碱性或高盐环境[1]。微藻种类繁多，估计有十万多种，而已知微藻的数量仅占1%，具有巨大的待开发潜力[2]。其中，许多微藻在适宜的环境条件下表现出高生长速率和高生物质产量，这一特性已被用于生物柴油、生物乙醇、生物制氢和生物沼气等生物衍生产品的生产[3]。与第一代生物燃料原料相比，尽管微藻的单位面积生产力更高，但如果没有高价值的副产品，其生产无法实现经济可持续性。因此，为了提高微藻能源的经济可持续性，需要在生物炼制方案下提高生物质的利用率，最大限度地挖掘生物质中的潜在价值。

微藻除了作为生物能源的原料，还可以用来生产高附加值的产品，例如，叶绿素、β-胡萝卜素、虾青素、藻蓝蛋白和ω-3不饱和脂肪酸等[2]。微藻还有许多潜在商业应用：如在造纸工业中作为纤维聚合物复合材料和填充材料[4]，化妆品制剂[5]，土壤修复和动物饲料的添加剂[6]以及必需氨基酸，脂质(甘油三酯、甘油二酯、磷脂和糖脂)和烯烃[7]等的来源。此外，微藻能有效吸附和回收重金属、吸收利用废水中的氮和磷，因此，可用于废水处理过程[8]。已有许多综述关注微藻的高价值产品和生物技术应用[8-9]，但有关微藻作为重要的潜在工业酶生产者的研究较少。

酶是催化生物反应的有机大分子，即所谓的“生物催化剂”，由于其底物特异性，酶常用于食品加工、制药和造纸等领域，以改善、扩展和优化工业化生产。目前，细菌和真菌酶(如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等)由于特异性高、副产品少，在食品工业中得到了大规模应用。全球酶市场产品由少数微生物酶主导，因此新品种酶的开发潜力是不可估量的。与其他微生物相比，微藻在工业酶合成方面具有一些优势，因为微藻通常是光合作用的水生低等生物，生长的营养需求低(天然或人造光、CO2、水和一些无机营养盐)，可以在光生物反应器中进行大规模培养，因此完全能适合工业市场领域的需求。因此，本文综述微藻在不同工业应用中合成酶的巨大能力，具体的酶包括碳酸酐酶、淀粉分解酶、半乳糖水解酶、酰基转移酶、脂肪酶、脂氧合酶、固氮酶、蛋白酶、腈水解酶、磷酸酶、植酸酶和硫解酶以及一些特殊的微藻源酶类，包括光酶、氢化酶及萜类物质合成相关酶，以期为相关研究工作提供参考。

1 与碳代谢相关的酶

1.1 碳酸酐酶

近年来，人们通过碳酸酐酶催化CO2转化为多种有益副产品，包括丙烯酸酯、聚碳酸酯、稳定的碳酸盐聚合物、甲烷或建筑材料[13]。在脊椎动物中，所有的碳酸酐酶都属于α-CAs，这种酶在莱茵衣藻的细胞质中也有发现，该藻中的碳酸酐酶已被证明与人类的碳酸酐酶具有同源序列，特别是人体中的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型碳酸酐酶(CAⅠ、CAⅡ和CA Ⅲ)[14]。其中，CAⅡ在人类健康方面有重要用途而被广泛研究。CA Ⅱ可以调节冷缺血引起的pH变化，被用作肝保护剂，它还可以改善待移植器官的保存[15]。鉴于微藻和人的碳酸酐酶的同源性及其在医学上的用途，微藻源的α-CAs可以作为这些酶的替代来源。因此，CAs可用作保护移植器官的酶，它有非常好的应用前景。

1.2 淀粉分解酶

淀粉酶(amylase)可以促进淀粉水解为低聚糖和多糖。最著名的淀粉酶有α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡萄糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、异淀粉酶(EC 3.2.1.68)和α-糖苷酶(EC 3.2.1.20)[16]。Levis等[17]发现莱茵衣藻在光自养培养条件下，光/暗周期为12 h/12 h循环时，整个细胞周期淀粉酶的活性都很高，但在黑暗条件下，4 h后其活性最强。Shang等[18]研究杜氏藻属(Dunaliella)中淀粉分解代谢酶的编码基因时，鉴定出了两种不同的代谢途径，一条水解途径和一条磷酸化途径。在德氏杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)中，与水解代谢相关的酶是α-淀粉酶和寡聚-1,6-葡萄糖苷酶；在小杜氏藻(Dunaliellaparva)中鉴定出了α-淀粉酶和β-淀粉酶。这3种酶负责淀粉的水解产生葡萄糖。而在淀粉的磷酸化分解过程中，小杜氏藻中为糖原磷酸化酶，德氏杜氏藻中为淀粉磷酸化酶。

1.3 α-D-半乳糖苷水解酶

α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(α-Gal，EC 3.2.1.22),也称α-半乳糖苷酶，可水解寡糖和半乳聚多糖中α-1，6-键连接的半乳糖残基，释放出α-D-半乳糖。半乳糖苷酶在纸浆、糖、食品和动物饲料工业中具有应用价值。

Brasil等[16]在一种吞噬混养型金藻——马勒海姆尾棕鞭藻(Poterioochromonasmalhamensis)中检测到了细胞内α-半乳糖苷酶(α-Gal)活性，这是一种具有渗透调节机制的单细胞金褐藻类；在pH 7.0时，α-半乳糖苷酶在马勒海姆杯棕鞭藻提取物中表现出最高活性；在较高的外部渗透压条件下，细胞在几分钟内收缩，细胞合成胞内异弗罗里多苷(isofloridoside)(α-半乳糖甘油)，这会诱导细胞内的α-半乳糖苷酶的产生，从而分解细胞内的异弗罗里多苷，释放出甘油和半乳糖；同时，释放出来的甘油或半乳糖中的一部分又被转化成葡聚糖储存在藻细胞中，或者作为细胞壁成分。由此可见，半乳糖和甘油作为渗透调节机制的产物在细胞内积累，维持重要的细胞活动。

Davies等[19]检测微藻的半乳糖苷酶活性时发现，在9种绿藻和蓝藻中，有8种表现出β-D-半乳糖苷酶活性，其中鼓藻(Cosmariumsp.)和斜生尖带藻(Acutodesmusobliquus)具有较高的酶活性。Girard等[20]在研究干酪乳清渗透液作为斜生尖带藻混养培养基的部分替代品时发现，乳糖可被该藻吸收利用，从而使培养基中乳糖浓度降低和胞内葡萄糖、半乳糖积累，以此推断该藻在细胞外产生了β-半乳糖酶。

Sanada等[21]使用乳清和其他工农业废料作为底物，从酵母、霉菌和细菌中生产α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，这些产品也可能是微藻合成半乳糖苷酶的潜在诱导剂。α-半乳糖苷酶诱导剂包括D-半乳糖、蜜二糖(melibiose)、水苏糖和棉籽糖，β-半乳糖苷酶诱导剂是乳糖。未来的研究需要重点分析α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶在微藻代谢中的作用。

1.4 二酰甘油酰基转移酶

微藻能积累大量的脂质，其中关于甘油三酯(TAGs)和多不饱和脂肪酸(PUFAs)的研究是最多的，特别是它们应用于生物柴油和营养食品[22]方面的研究。TAGs是由甘油和脂肪酸(FA)衍生而来的酯类，它们通常储存在细胞质的脂滴中，可通过酸或碱催化的酯交换反应生产生物柴油。就PUFAs而言，其有益健康的功效已得到充分证明，尤其是ω-3多不饱和脂肪酸，如二十碳五烯酸(EPA) 和二十二碳六烯酸(DHA)[23]。

脂质合成过程中最受关注的酶是二酰甘油酰基转移酶(DGAT, EC 2.3.1.20)，它催化TAG生物合成途径的最后一步反应，该酶有3个独立的酶组分，分别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型的二酰基甘油酰基转移酶(DGATⅠ、DGATⅡ、DGATⅢ)。Guo等[24]在椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)中发现了编码DGATⅠ的基因，随后在产油微藻海洋微拟球藻(Nannochloropsisoceanica)中进行了DGATⅠ过表达的研究[25]，最初的DGATⅡ序列是从单细胞绿藻——金牛鸵球藻(Ostreococcustauri)获得的，并进行了DGATⅡ过表达研究[11]。DGATⅡ的过表达促进硅藻——三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和假小海链藻(Thalassiosirapseudonana)以及富油新绿藻(Neochlorisoleoabundans)和海洋微拟球藻(N.oceanica)中TAG产量的增加[22]。不同的DGAT Ⅱ同工酶(NoDGAT ⅡA、ⅡC、ⅡD)已被鉴定出来，Xin等[26]分析了其基因在过表达或低表达的不同组合时油脂的响应情况，这些组合可产生不同的脂肪酸组成，其中一些可针对脂肪酸营养需求进行优化，而其他则可针对生物燃料进行优化。在莱茵衣藻中过表达不同DGAT Ⅱ的亚型后，有的可以显著提高TAG含量，有的对TAG的含量没有显著影响[22]。最近，Cui等[27]在三角褐指藻中鉴定了一种双功能蜡酯合酶(WS)/ DGAT酶，将其过表达可同时提高TAG和蜡酯的积累量。

除DGAT以外，还可以过表达其他基因以提高高价值脂质产量，包括葡萄糖6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)、Δ6-去饱和酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)、甘油3-磷酸酰基转移酶(GPAT1-GPAT2)和乙酰辅酶A合成酶2(ACS2)的基因，这些酶的基因过表达可提高脂质含量[22]。

1.5 脂肪酶

脂肪酶(lipase, EC 3.1.1.3) ，又称三酰基甘油酰基水解酶，是天然水解甘油三酯生成脂肪酸和甘油的酶。然而，在水受限的环境中，它们可以催化酯化、酯交换、酯间酯化和氨解反应[16]，广泛应用于洗涤剂、食品、香料、医药、化工、农药和化妆品行业中，所以脂肪酶是生物技术应用中最重要的酶之一。

与细菌、真菌、动物和植物的脂肪酶相比，微藻的脂肪酶及其编码基因研究较少。Demir等[28]最先从钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)中分离并鉴定了一种脂肪酶，该脂肪酶经纯化后，比酶活为45 U/mg，该酶蛋白具有单体性和对酯键3位的特异性。Godet等[29]从球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)中鉴定出一个新的基因，该基因编码457个氨基酸，分子量为4.9×104脂肪酶，并研究发现该蛋白质与已知的脂肪酶相似，系统发育分析显示与真菌脂肪酶序列同源。

近十年来，研究绿藻脂质代谢的模式微藻主要是莱茵衣藻，它的基因组中存在许多编码脂肪酶的基因。与许多其他微藻一样，莱茵衣藻在氮缺乏的情况下会积累三酰甘油(TAG)，这种情况会导致全基因组的转录本改变，在缺氮调控的基因中，有许多编码脂肪酶的基因[30]。Li等[31]鉴定了莱茵衣藻的一株突变体，当微藻在氮缺乏时，半乳糖-甘油脂酶的编码基因表达上调，如果破坏半乳糖-甘油脂酶编码基因则会导致TAG含量的降低和半乳糖-甘油脂的水解。Mansfeldt等[32]也证实，在氮缺乏条件下小球藻(Chlorellasp.)的半乳糖-甘油脂酶的基因表达上调。在莱茵衣藻中，与TAG水解有关的脂肪酶基因在氮缺乏时表达下调[31]，Li等[31]鉴定出了该脂酶编码基因CrLIP1，并发现：在TAG积累过程中，编码水解TAG、DAG (二酰甘油)或MAG (单酰甘油)的脂肪酶基因的表达被抑制；当再次补氮时，CrLIP1转录本数量减少，TAG水解有所延迟，这证实了CrLIP1参与了衣藻TAG脂解，CrLIP1编码的脂肪酶可以水解由TAG脂解生成的DAG，促进TAG的转换。

Yong等[33]从苏德台葡萄藻(Botryococcussudeticus)中制备、纯化并鉴定了一种胞外脂肪酶，对其研究发现：在人工光源续光照以及室温条件下，添加橄榄油并进行搅拌是其生产脂肪酶的最佳条件；纯化后的脂肪酶分子量为1.2×105，在50 ℃、pH为10时，具有最大活性,该脂肪酶还具有良好的热稳定性，应用潜力巨大。

1.6 脂氧合酶

脂氧合酶(LOXs,EC 1.13.11.12)是专一催化含有1，4 -顺式戊二烯体系的不饱和脂肪酸双加氧生成顺式、反式共轭的单氢过氧化物的酶。当亚油酸作底物时，这些酶催化产生脂氧素13-氢化氧-9，11-十八烯二烯酸(13-HPODE)和9-氢化氧-10，12-十八烯二烯酸(9-HPODE)[34]。许多脂氧素(oxylipins)途径的产物都参与植物防御机制，如由植物产生的茉莉酸酯和挥发性化合物(主要是十八烷类和十六烷类)，可激活其对昆虫和病原体的防御机制[34]。此外，亚油酸的羟基衍生物表现出抗菌性能[3]。

脂氧合酶(LOXs)是脂氧素途径的起始酶和关键酶，虽然这些酶存在于不同的生物体中，但是它们是多系起源的[35]。海产红藻——坛紫菜(Pyropiahaitanensis)中的脂氧合酶具有多个催化位点，Chen等[35]分析了它们的不同反应产物，发现该酶是一种多功能酶，具有脂氧合酶、过氧化物裂解酶(HPL)和氧化丙二烯合酶(AOS)活性。多功能的LOXs在自然界是非常稀缺的，但在海洋藻类中包含以20碳多不饱和脂肪酸为底物的5R、8R、9S、12S和15S脂氧合酶，以及催化十八碳的ω3、ω6、ω9和ω10脂氧合酶[3]。因此，红藻和硅藻的脂氧素代谢具有动物(二十烷类)和植物(十八烷类)脂氧素的双重特征，可参与免疫调节。这种在红藻中既可以产生动物型脂氧素，又可以产生植物型脂氧素的代谢，是由高度多样性的LOXs所催化的，由此藻类被认为是脂氧素多样性最丰富的生物[3]。

许多藻类的LOXs是非特异性，可以催化不同的多不饱和脂肪酸。如坛紫菜中的LOXs以C18～C22为底物，催化γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸产生不同的脂氧素[35]。该藻仅用一种脂氧合酶(PhLOX2)可催化4种多不饱和酸得到16种不同的脂氧素产品。脂氧素参与藻类的生物防御机制，如网翼藻(Dictyopterissp.)可抵御食草片脚类动物(herbivorous amphipods)[36]，而硅藻细胞内的醛脂氧素对细菌、真菌甚至无脊椎动物具有毒性[37]。由此可见，使用藻类的LOXs生产/诱导脂氧素是研究生物防治一个巨大的机会。

1.7 硫解酶

硫解酶(thiolase)是一种分布广泛的酶，它存在于原核生物和真核生物中。这个酶家族可以进一步细分为分解代谢型硫解酶(EC 2.3.1.16)和合成代谢型硫解酶(EC 2.3.1.9)，两者都能催化2个乙酰辅酶A分子缩合生成乙酰乙酰辅酶A。硫解酶是延伸碳骨架的关键酶，从代谢前体乙酰辅酶A开始合成其他化合物。合成型的硫解酶仅能利用乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A作为底物。然而，分解代谢型的硫解酶可针对不同的底物，包括参与脂质代谢的分子量较大的底物(如3-酮癸酰辅酶A)。

硫解酶存在于微藻的不同细胞器中：在转板藻(Mougeotiasp.)中，硫解酶和酰基辅酶A氧化酶只存在于过氧化物酶体中；而在拟杆藻(Bumilleriopsissp.)中，所有脂肪酸氟氧化途径的酶(包括巯基酶)都在线粒体中[38]；在纤细裸藻(EuglenagracilisKlebs)和独球藻(Eremosphaerasp.)中，在过氧化物酶体和线粒体中，都发现了硫醇化酶和酰基辅酶A氧化酶[38]。人们对硫解酶的兴趣越来越大，因为它们是甲羟酸途径中合成几种甾醇(例如麦角甾醇)的关键酶。麦角甾醇是真菌和藻类的主要甾醇，它是由乙酰辅酶A产生的，被证明具有抑制癌症和肿瘤生长的作用[39]。为了获得较高的麦角甾醇产量，已有一些关于提高硫解酶活性的研究，然而，仅仅提高硫解酶活性并不足以在酵母中获得高水平的甾醇。在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，麦角甾醇含量高时，乙酰辅酶A硫解酶的活性受到抑制，而麦角甾醇含量低时，其活性增加[40]。乙酰辅酶A硫解酶(thiolaseⅡ)通过甲羟酸调节异戊二烯的生成，它是蓝盒藻(Cyanophorasp.)、加尔迪藻(Galdieria)、花青藻(Cyanidium)、中眼藻(Mesostigma)和裸藻(Euglena)等生物合成类胡萝卜素的关键酶，但绿藻已经失去了这一代谢途径[41]。

藻类中异戊二烯类化合物的代谢工程引起了人们的关注，主要是因为它们在工业上的应用价值极大。通过硫解酶Ⅱ和3-酮脂酰硫解酶3-ketothiolase可以获得乙酰乙酰辅酶A，以此来生产聚羟基丁酸酯(PHB)，它是生物可降解塑料的重要前体，还可以用来生产丁醇。因此，藻中的硫解酶是甾醇和异戊二烯生物合成的关键酶，在酶促级联的策略下，可以用于生物塑料和生物燃料的制造。

2 与氮代谢有关的酶

2.1 固氮酶

固氮酶(nitrogenase)是生物固氮的关键酶，蓝藻是生态系统中完成这一重要功能的主要生物体。固氮酶是一种酶的复合物，由二硝基酶(Mo-Fe蛋白, EC 1.18.6.1)和二硝基还原酶(Fe蛋白, EC 1.19.6.1)组成。二硝基酶钼铁蛋白是一种四聚体，其亚基由nifD和nifK基因编码，二硝基还原酶铁蛋白有2个相同亚基的二聚体，由nifH基因编码[3]。铁蛋白从外部供体(铁氧蛋白或黄素蛋白)收集电子，并通过ATP依赖的过程将电子转移到钼铁蛋白，钼铁蛋白利用还原能力将N2转化为铵。

蓝藻的固氮作用在许多自然和人工生态系统中具有重要的生态意义。例如，每年稻田中的蓝藻固氮量为5 g/m2，而极地地区浅湖中的蓝藻固氮极其重要，每年达1.5 g/m2。在海洋生态系统中，一些蓝藻，如束毛藻(Trichodesmiumsp.)和胞内植生藻(Richeliaintracellularis)(与硅藻结合)是主要的固氮成员，固氮量可与硝酸盐输入量相当[43]。在全球范围内，海洋固氮量估计与陆地固氮量相近((1～2)×108t/a)，束毛藻(Trichodesmium)固定(6～8)×108t/a的氮。蓝藻巨大的固氮能力对生态系统和人类活动非常有价值，比如水稻生产时，固氮蓝藻在其生产周期内固氮量可达70～110 kg/ha。

2.2 蛋白酶

蛋白酶(protease)是一大类催化蛋白质和肽分子的肽键裂解的酶，广泛应用于洗涤剂、制药和食品工业。在微藻代谢过程中，蛋白酶活性在光照或营养盐受限制等胁迫条件和细胞凋亡时反而增加，蓝藻中的蛋白酶在控制细胞器衰老和异形胞形成中也发挥作用[15]。

Lockau等[44]研究了一种来自蓝藻——多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis)钙依赖性的丝氨酸蛋白酶，该酶是一种类似胰酶的蛋白酶，需要钙才能充分发挥活性。Strohmeier等[45]研究缺乏这种钙依赖性蛋白酶的多变鱼腥藻突变体IM 141时发现，多变鱼腥藻中含有第二种可溶性类似胰蛋白酶的蛋白酶，即脯氨肽酶(prolylendopeptidase)。Niven[46]利用多变鱼腥藻首次纯化了氨肽酶，用凝胶过滤色谱法分离出2种不同分子量大小的酶(1.88×105和5.9×104)，并研究了它们对不同的底物特异性，较大的酶对二肽和三肽具有特异性，而较小的酶能够水解较长的寡肽。Nanni等[47]从钝顶节旋藻中分离纯化了一种新型的丝氨酸蛋白酶，并对其进行了部分表征。Yada等[48]从钝顶节旋藻中纯化了一种新的精氨酸特异性蛋白酶(Sp-蛋白酶)，该酶可以水解明胶和纤维蛋白，但不能够水解藻蓝蛋白。这2种酶的分子量均为8.0×104，且不依赖于Ca2+。由此可知，微藻具有产蛋白酶的能力，且蛋白酶的产生与氮源的浓度和类型有关[49]，因此未来的研究应着重评估培养基中氮源的变化对微藻产蛋白酶及其活性的影响。

2.3 腈水解酶

腈水解酶(nitrilase,EC 3.5.5.1)是一种用途广泛的腈代谢酶，可取代强酸或碱催化剂而对腈进行水解反应。腈是氰基取代的羧酸，一般结构为R-CN，这些化合物被大规模合成，用作塑料工业、合成橡胶以及制药、除草剂和其他重要化学品工业的原材料[3]。此外，大多数腈类具有高毒性，利用生化法来降解它们是工业水体污染处理和土壤解毒的有效方法[50]。

在植物中，腈水解酶参与氰化物和氰化糖苷的分解代谢，可能还参与硫代葡萄糖苷的分解代谢。氰化物是植物激素乙烯生物合成过程中的代谢副产品，而腈水解酶可将中间产物β-氰丙氨酸转化为天冬酰胺、天冬氨酸和氨，在许多微藻中发现了腈水解酶，并以吲哚-3-乙腈为底物合成吲哚-3-乙酸，微藻腈水解酶的活性位点有1个半胱氨酸残基，当其巯基未质子化时，半胱氨酸残基可作为亲核试剂催化底物[51]。尽管利用微藻进行氰化物分解的研究较少，但是微藻源的腈水解酶还是有望应用于分解氰化物。Gurbuz等[52]研究发现，蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)具有将氰化物转化为β-氰丙氨酸和γ-谷氨酰-β-氰丙氨酸的能力，并将其作为碳源和氮源，进行再次利用。此外，微藻生长所需的营养物质比一些细菌和真菌少，而一些微藻如斜生四链藻(Tetradesmusobliquus)能在68 h内分解400 mg/L的氰化物[52]，采矿废水中通常含有大量氰化物，因此可以用斜生四链藻去除氰化物作为一种可行的矿物废水生物处理工艺。含有腈水解酶或游离腈水解酶的藻类可能是生物修复过程的一个很好的选择，然而，需要更多有关提高藻类腈水解酶含量和活性的研究结果来支持这一观点。

3 与磷代谢有关的酶

3.1 磷酸酶

磷酸酶(phosphatases)是一类催化有机物释放无机磷的酶，基于此，植物、藻类和真菌等都能利用磷。由于海水的pH为碱性(8.3)，所以在海藻中主要产生的是碱性磷酸酶(AP, EC 3.1.3.1)，但是这些磷酸酶在细胞内不是以游离状态存在，它们主要存在于藻类细胞的细胞壁、外膜或细胞质周间隙中。AP对磷的浓度非常敏感，因此有利用石花菜属(Gelidium)、刚毛藻属(Cladophora)、多管藻属(Polysiphonia)和虾夷杉藻属(Stypocaulon)藻细胞内AP活性变化来进行环境监测的研究[53]。单细胞藻类如普通链带藻(Desmodesmuscommunis)和台湾星杆藻(Asterionellaformosa)的磷酸酶活性变化可用作胞内磷状态的指示物[54]：一般来说，当磷的利用率较高时，磷酸酶活性较低，反之亦然。然而，磷酸酶活性的增加或减少，主要取决于磷的浓度。

因为AP对重金属污染的敏感性，所以磷酸酶可用于水质监测。小球藻的AP已被用作重金属(Cd2+和Zn2+)废水的生物传感器，这对持续监测水体具有重要意义，当四尾栅藻和钩背隐杆藻(Aphanothecenidulans)暴露于Ni2+、Zn2+和Cd2+时，AP活性下降，而钝顶节旋藻暴露于Cd2+和Hg2+时AP活性下降[55]。同时，藻细胞可以被固定化后重复利用，这为简单快速检测水体中的重金属污染提供了可能。

一些藻类的磷酸酶具有重要的生物学作用。甘露醇是一种多聚醇，在藻类中用作渗透保护剂，在医学和工业上有许多应用。它可以作为一种神经保护化合物用于帕金森治疗，并在多种手术中控制颅内压升高和保护肾脏[56]。甘露醇是褐藻中储藏型碳水化合物的主要成分之一，可占其干质量的20%～30%，该多元醇通过两个酶促反应生成。首先，甘露醇-1-磷酸脱氢酶将果糖-6-磷酸还原为甘露醇-1-磷酸，随后甘露醇-1-磷酸磷酸酶将甘露醇中的磷酸基团释放出来，生成甘露醇。Groisillier等[57]鉴定了长囊水云(Ectocarpussilicolosus)的甘露醇磷酸酶基因(EsM1Pase1和EsM1Pase2)，与鹧鸪菜(Caloglossacontinua)和微胞藻(Micromonassp.)的甘露醇磷酸酶进行比对，结果发现，褐藻的甘露醇磷酸酶的序列和其直系同源基因代表一个新的磷酸酶家族，在卤酸(haloacid)脱氢酶超家族中具有新的底物特异性，可以将这些基因克隆到细菌中进行异源表达以获取酶。因此，利用特异性的藻类磷酸酶催化生产甘露醇可作为一种从果糖中提取甘露醇的替代方法。

因此，藻类磷酸酶不仅在水体磷循环中具有重要的生态意义，而且已被成功地用作磷有效性和重金属生物传感器，在生物监测领域具有重要的应用价值，并且藻类磷酸酶可以进一步应用到其他领域，如用于生产甘露醇。

3.2 植酸酶

植酸酶(phytases) ，又称肌醇六磷酸酶，能够水解去除植酸中的磷酸残基，而植酸是谷物和植物种子中有机磷(P)储存的主要分子。植酸酶可以添加到动物饲料中以提高磷的生物利用度，同时植酸酶在食品加工中具有潜在应用价值[16]。根据植酸脱磷酸化起始位置，植酸酶可分为以下3种类型: 3-植酸酶(EC 3.1.3.8)、6-植酸酶(EC 3.1.3.26)和5-植酸酶(EC 3.1.3.72)。

Klanbut等[58]从泰国分离了4种耐热蓝藻：青灰聚球藻SKP50(Synechococcuslividus)、青灰聚球藻DSK74(Synechococcuslividus)、双粒聚球藻(Synechococcusbigranulatus)和嗜热拟色球藻(Chroococcidiopsisthermalis)，从这4种蓝藻中都检测到了植酸酶活性，青灰聚球藻SKP50的植酸酶最大活性为1.83 mU/mL。虽然细胞外培养液中植酸酶活性不高，但可以进一步研究来确定微藻是否能够产生植酸酶以及该酶是否为胞外酶。此外，可以在未来的研究中优化培养基成分，即用特定底物(如有机磷源)来诱导合成植酸酶。

4 氢化酶

氢化酶(H2ases, EC 1.12.1.12)是催化分子氢氧化或者质子还原这一可逆过程的酶。它们在微生物代谢中发挥着核心作用，是光合生物产生H2的重要酶。根据氢化酶的活性中心所含金属不同，氢化酶可分为三类：[Fe]-H2ases、[NiFe]-H2ases和无金属H2ases[59]。这些酶可用于生物制取H2，比现有的物理化学制氢方法在环境保护方面有明显的优势。生物光解产氢是指利用微生物，通常是微藻和/或蓝藻，通过光合反应将水和太阳能转化为H2和O2[59-60]。微藻产生H2的基础是光系统1(PS1)被激活而产生电子转移，电子先流向铁氧化还原酶，再流向氢化酶，整个过程都在类囊体结构中发生。在绿藻的叶绿体中，铁氧蛋白作为[Fe]-H2ase的电子供体。

现在研究生物制氢的主要藻类是衣藻，也有以螺旋藻和鱼腥藻[60]为研究对象生物制氢的研究。此外，普通小球藻(Chlorellavulgaris)和奥古斯塔衣藻(Chlamydomonasaugusta)也具有转化光能制氢的能力。由于藻类制氢的产量非常低，如果想要达到商业生产的水平，就需要更多的研究来达成这一目标。

5 微藻源光酶

光酶(photoenzyme)是催化光化学反应的酶类，它们的催化活性由光驱动，而且需要持续光照才能一直起作用[61-62]。自然界中光酶的存在类型较少，目前主要有3个家族的蛋白拥有光催化活性，即光修复酶(photolyase,EC 4.1.99.3)、光依赖型NADPH:原叶绿素酸酯氧化还原酶(LPOR, EC 1.3.1.33)以及脂肪酸光脱羧酶(FAP, EC 4.1.1.106)。

紫外光(UV)辐射可导致同一条DNA链上两个临近的胸腺嘧啶共价结合形成环丁烷嘧啶二聚体(CPD)或6-4嘧啶-嘧啶酮光产物(6-4PPs)，阻碍DNA的正确复制和转录，不利于细胞的生命活动，甚至引起细胞死亡[63]。光修复酶是在可见光下能够修复紫外损伤产物CPD和6-4PPs的这类黄素蛋白，根据修复底物的不同，分为CPD光修复酶和6-4PPs光修复酶[64]。光修复酶修复损伤DNA的基本过程是先识别底物，然后进行特异性的结合，在近紫外-蓝光(300～500 nm)照射下，一个电子从被激发的黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH-)转移给DNA底物，得到电子的底物裂解成一个嘧啶单体和一个嘧啶单体阴离子自由基，后者将多余的电子返还给中性状态的FADH·，恢复两个嘧啶单体和具有催化活性的FADH-；最后，光修复酶从修复的DNA上解离下来，完成DNA光修复过程。

随着对光修复酶的深入研究，研究者们发现光修复酶和隐花色素的序列高度同源，他们将光修复酶和隐花色素共同归属于隐花色素/光修复酶家族(cryptochrome/photolyase family，CPF)[65]。在对藻类CPF的研究中发现隐花色素/光修复酶的功能并没有完全分开。例如：三角褐指藻中的PtCPF1既能够修复6-4PPs，又可以调控蓝光受体[66]；金牛鸵球藻(Ostreococcustauri)中的OtCPF1可以修复6-4PPs，调控生物钟；莱茵衣藻中的aCRY能够修复6-4PPs，同时调控蓝光受体和红光受体。这些结果说明藻类中的光修复酶仍保留了一些相对原始的功能，对于研究自然界中光修复酶的进化机制具有重要意义。

图1 辅酶NADPH存在时，NADPH:原叶绿素氧化还原酶在光驱动下将原叶绿素酸酯还原为叶绿素酸酯[67]Fig.1 Light-induced reduction of protochlorophyllide to chlorophyllide catalyzed by the enzyme NADPH:protochlorophyllide oxidoreductase in the presence of NADPH as cofactor[67]

脂肪酸光脱羧酶(FAP)是近些年才在多变小球藻(C.variabilisNC64A)和莱茵衣藻中发现的一种光酶，它以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶，在蓝光下可将脂肪酸转化为烃类化合物，其作用机制是将FAD的生物催化性质和光受体性质结合在一起，通过自由基化学催化脂肪酸，移除脂肪酸中的羧基，从而形成烃类化合物[62]，具体催化过程如图2所示，这个过程既可以通过一步催化(红色框)，也可以通过三步催化(蓝色框)，从而将脂肪酸转化为烷烃类化合物[61]。这种光酶的发现对于从藻类中生产烷烃类燃料提供了新方法，同时也为利用光酶高效清洁制备燃料提供了新思路。

图2 脂肪酸光脱羧酶催化脂肪酸转化为烃类化合物[61]Fig.2 Hydrocarbons from fatty acid by photodecarboxylase [61]

6 与萜类物质合成有关的酶

萜类化合物或异戊二烯类衍生物(terpenoid/isoprenoid)是一类具有较强结构多样性、显著生物活性的碳氢化合物，其骨架多样性主要归因于萜烯合成酶类(terpene synthases)[70]。陆生植物和藻类能产生大量萜类化合物，通常是通过甲羟戊酸(MVA)途径或非甲羟戊酸(MEP/DOXP)途径实现。MVA途径以乙酰辅酶A为原料，合成异戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)；而MEP途径是以丙酮酸和3-磷酸甘油醛为原料，2-甲基赤藓醇磷酸(MEP)为中间产物，达到合成IPP和DMAPP的目的。IPP和DMAPP在焦磷酸盐合成酶(pyrophosphate synthases)的作用下可以缩合成高阶的碳骨架，即不同种类的焦磷酸(分别为GPP、FPP和GGPPS)，这些是构成由萜烯合成酶活性介导的类异戊二烯产物的基础[71]。单萜合成酶(mTPS)催化GPP生成C10单萜化合物，倍半萜合成酶(sTPS)催化FPP生成C15倍半萜化合物，三萜合成酶(tTPS)催化C30角鲨烯生成三萜化合物(角鲨烯是由2个FPP分子通过角鲨烯合成酶生成的)，二萜合成酶(diTPS)催化C20 GGPP生成二萜类化合物 (图3)[72]。

图3 萜类化合物次级代谢[72]Fig.3 Terpenoid secondary metabolism[72]

目前已知两种类型的萜烯合成酶：典型的植物萜烯合成酶和微生物类萜烯合酶(MTPSL)，其中MTPSL基因是近年才被发现的，可能只出现在非种子植物中[73]。Kersten等[74]从大型红藻——太平洋凹顶藻(Laurenciapacifica)和枝状凹顶藻(L.dendroidea)的转录体中鉴定出几个萜烯合成酶基因，其中LphTPS-A是目前已知的第一个具有生物化学特征的红藻倍半萜合成酶，被认为参与了红藻倍半萜天然产物的最初生物合成途径，能够合成prespatane。红藻中萜烯碳骨架的形成是由MTPSL酶完成的，MTPSL酶在系统发育上与典型的植物萜烯合成酶无关，由此推断MTPSL酶很可能是起源于红藻门[70]。

角鲨烯是绿藻合成萜类化合物中最常见的C30产物，其中布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)能够产生大量液态烃，且只能通过MEP途径合成萜类化合物，从B型布朗葡萄藻中分离并鉴定到的角鲨烯合成酶(SS)，能够利用FPP为底物合成角鲨烯，将这一代谢途径与布朗葡萄藻合成葡萄藻烯(botryococcene)的途径相比较后发现布朗葡萄藻中不同三萜的代谢途径是相似的[75]。Thapa等[76]对L型布朗葡萄藻的转录组测序时，破译了一种四萜类碳氢化合物番茄八烯(lycopaoctaene)的合成途径及其关键酶LOS。与SS酶不同，LOS酶对底物的专一性不强，能够利用不同种类的底物单独或组合合成6种不同的C30、C35和C40链长的碳氢化合物(图4)，如利用GGPP合成番茄八烯，或利用FPP合成PSPP，从而转化为角鲨烯等。在B型布朗葡萄藻的MEP途径中，研究人员发现催化初始步骤的酶DXS和最后两个步骤中的酶4-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶(HDS)和4-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是决定其萜类化合物积累产量的关键调节酶[77]。除此之外，在模式绿藻莱茵衣藻中也获得了两种参与角鲨烯合成和代谢相关的酶：角鲨烯合成酶(CrSQS)和角鲨烯环氧化酶(CrSQE)，这两个酶基因分别编码与膜结合的SQS和SQE，参与莱茵衣藻中角鲨烯的合成以及代谢途径[78]。

图4 布朗葡萄藻中角鲨烯和番茄二烯的生物合成[76]Fig.4 Biosynthesis of squalene and lycopadiene biosynthesis in Botryococcus braunii race L[76]

柠檬烯是一种典型的植物单萜，具有广泛的用途，而在蓝藻中，柠檬烯是无法自然合成的。近年来，对柠檬烯合成酶(LimS)在蓝藻中异源表达的研究逐渐增多，现有的关于蓝藻合成柠檬烯的研究，主要利用了几种来自不同植物(荆芥、云杉和薄荷)的limS基因[79]，这些基因被优化后在蓝藻中进行异源表达，能够成功地合成柠檬烯。另外，蓝藻也是土味素(geosmin)的主要来源，Agger等[80]在2株蓝藻(PCC 7120和PCC 73102)中鉴定了3个参与合成土味素的倍半萜合成酶NS1、NP1和NP2的生理生化特性。其中，NS1和NP1属于一个明显的微型蛋白家族的一部分，包含1个细胞色素P450和1个位于该萜烯合成酶下方的未知混合双组分蛋白，且P450基因与其相邻的萜烯合成酶基因在大肠杆菌中能够共表达，并能功能性氧化NS1催化的萜烯产物，这是目前所知第一个蓝藻细胞色素P450基因在大肠杆菌中功能性表达的例子。

微藻具有繁殖速度快、生物量容易积累和易于遗传操作等优点，在代谢组学、转录组学、基因工程等手段的帮助下，有望发展成为一种商业化的萜类化合物的生产者。与化学合成的萜类化合物相比，天然萜类化合物无构型选择等问题，能够表现出更高的潜在生物活性。

7 结论与展望

微藻既可作为细胞工厂生产有用的物质，也可作为生物炼制的原料。本文综述了微藻酶在工业生产、生物修复和生物监测等方面的研究进展，微藻是发现新的生物催化剂的新来源，这些催化剂可以在微藻的光生物反应器中生产，或者在细菌中通过异源表达合成来生产。随着越来越多的微藻酶在食品、药物和化学工业中的应用，这为开发新策略与新方法来诱导和优化微藻酶的生产，特别是微藻酶源的工业化生产提供重要市场。尽管微藻有潜力成为新型酶的来源，但是对这一领域的研究还不够深入，很多关键问题没有解决，需要进一步深入研究。与细菌、酵母或真菌相比，微藻的培养时间更长，并且需要额外的下游工艺技术来回收细胞内的酶，更重要的是，大部分藻酶在细胞内的合成量相当少，这使得微藻酶在实际应用和工业放大生产时面临挑战。随着遗传工程和合成生物学的发展，加上在生物炼制时，使用整个藻体生产多种生物产品，为克服现阶段微藻酶生产过程中出现的限制提供了可能性，并为未来实现在微藻细胞中具有经济效益的工业酶的生产提供了机遇。