微生物产角蛋白酶及其应用

熊 敏，廖永庆，张 敏，苗朝棋，蔡冬波，陈守文

(1.湖北大学 生命科学学院 省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室，湖北 武汉 430062；2. 武夷学院 生态与资源工程学院 绿色化工技术福建省高等学校重点实验室，福建 武夷山 354300)

角蛋白是广泛存在于动物皮肤及其衍生物(如毛发、鳞甲和羽毛等)中的蛋白质，在自然界中的丰度仅次于甲壳素和纤维素，排在第三位。角蛋白是纤维状蛋白质，其化学键(二硫键、氢键和疏水相互作用)的取向和相互作用使角蛋白具有特殊的结构，能抵抗多种常用蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的降解[1]。

角蛋白废弃物具有转化为增值产品或生物能源的巨大潜力，目前角蛋白废弃物的利用往往涉及污染较大的物理和/或化学前处理过程，随着“生物催化”这种绿色技术的出现，用可降解角蛋白的角蛋白酶代替高能耗、重污染的物理和/或化学过程越来越受到重视。角蛋白酶的应用领域不只局限于角蛋白废物的去除和转化，还在工业、医药和化妆品等行业得到广泛应用[2]。本文综述了角蛋白酶的来源、分类和性质，蛋白改造，高效表达育种，发酵工艺优化以及角蛋白酶的应用。

1 角蛋白酶来源、分类及性质

细菌中的芽孢杆菌属Bacillus是最主要的产角蛋白酶的微生物，其中Bacilluslicheniformis是第一个商品化的耐热角蛋白酶VersazymeTM的来源[3]；放线菌中的链霉菌属Streptomyces也有多个种可以产角蛋白酶；此外，还有Clostridium、Chryseobacterium、Fervidobacterium、Thermoanaerobacter、Kocuria、Stenotrophomonas、Kytococcus、Lysobacter、Vibrio、Brevibacillus、Pseudomonas、Serratia、Microbacterium、Aeromonas、Burkholderia、Rhodococcus、Geobacillus、Amycolatopsis、Meiothermus和Paenibacillus等[4]。

而产角蛋白酶的真菌有Aspergillus、Doratomyces、Myrothecium、Paecilomyces、Scopulariopsis、Trichoderma、Trichophyton、Fusarium、Acremonium、Onygena、Cladosporium、Microsporum、Lichtheimia、Chrysosporium和Aphanoascus[5]。

角蛋白酶大多为单体酶，但也有寡聚酶。根据酶催化中心的特点可以将角蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶及丝氨酸-金属蛋白酶[6]。按照MEROPS肽酶数据库对蛋白酶的分类，目前已知的角蛋白酶归属于14个蛋白酶家族：S1、S8、S9、S10、S16、M3、M4、M14、M16、M28、M32、M36、M38和M55。其中，归为内切酶的有S1、S8、S16、M4、M16和M36，归为外切酶的有S9、S10、M14、M28、M38和M55，还有2个家族M3和M32只水解寡肽中的肽键[6]。

不同来源的角蛋白酶分子量差别较大，如来自Streptomycesalbidoflavus的角蛋白酶分子量为1.8×104，来自Kocuriarosea的角蛋白酶的分子量则高达2.4×105，但是角蛋白酶的分子量主要集中在(2.0～5.0)×104范围内，且多为丝氨酸蛋白酶[5,7]。角蛋白酶的最适pH通常为7.5～9.0，最适温度为40～60 ℃[6]，从一些极端环境微生物中分离的角蛋白酶具有更高的最适pH和更高的最适温度，如Nocardiopsissp. TOA-1的最适pH超过12.5[8]，FervidobacteriumislandicumAW-1的最适温度达到100 ℃[7]，这类能耐高温和强碱的角蛋白酶在大规模降解角蛋白时更具应用价值。表1列举了部分角蛋白酶的理化性质。

表1 部分角蛋白酶的理化性质

一些二价金属离子，如Ca2+、Mg2+和Mn2+等对角蛋白酶有激活作用，而一些过渡金属离子和重金属离子(如Hg2+、Ni2+、Cd2+和Cu2+)则抑制角蛋白酶的活性[15,18]；有机溶剂和表面活性剂/去污剂对角蛋白酶的活性影响是多样的，但还原剂的添加对角蛋白酶的活性有促进作用[9,12]。

2 角蛋白酶分子改造

从野生型微生物中分离的角蛋白酶的催化活性通常不高，而且难以耐受工业过程中的高温、高盐、极端pH、去污剂、有机溶剂或氧化剂等加工条件[19]。为了扩大角蛋白酶的应用范围，有必要对酶进行针对性的改造。用于酶改造的蛋白质工程技术有非理性设计(如定向进化)和理性设计(如定点突变、结构域截短、结构域融合等)[20-21]。

2.1 提高酶催化效率

酶分子改造的目的之一是提高酶的催化效率，可通过调整酶活性中心的结构、静电作用或增大疏水相互作用，提高酶对底物的亲和力、结构的稳定性等来实现。常用的方法有C端截短、同源蛋白结构域替换以及氨基酸残基突变等。蛋白酶的C端结构域富含疏水氨基酸，与酶的热稳定性、蛋白折叠和底物特异性相关，通过截短C端结构，有利于酶的稳定、活性中心空间折叠及增强底物特异性，从而提高酶的催化效率。Yan等[22]通过截短C端的PPC结构域使蛋白酶的kcat/Km值由346 mmol/(L·s)提高到2 978～3 927 mmol/(L·s) 。Ribitsch等[23]通过截短角蛋白酶HP70的C端结构域，使突变体对特定底物SUC-AAPF-pNA的催化活性提高了4倍。Fang等[24-25]通过截短角蛋白酶羧基端序列，使酶的催化活性提高1.7倍[24]，通过互换同源角蛋白酶的功能域使酶的催化活性提高2倍、60 ℃的半衰期延长至244.6 min[25]，通过对前导肽的定点突变(S180G/Y215S)，角蛋白酶的比酶活提高1 300 U/mg，达到4 725 U/mg[26]。

2.2 改变底物特异性

通过理性设计定点突变可改变底物结合部位的大小、结构或静电亲和力，进而改变酶对底物的特异性。来自Stenotrophomonasmaltophilia角蛋白酶KerSMD的PPC结构域具有结合、水解胶原蛋白的活性，Fang等[24]将该结构域删除后，使该酶只能水解角蛋白不能水解胶原蛋白，从而应用于皮革加工领域。

2.3 增强对化学试剂(表面活性剂)的耐受性

相对于一般的蛋白酶，角蛋白酶对表面活性剂和有机溶剂有更好的耐受性，越来越多地被用于洗衣剂中。为了进一步增强角蛋白酶在洗衣剂中的稳定性，Fang等[25]将来源于S.maltophilia的角蛋白酶的C端截短，极大地增强了角蛋白酶对表面活性剂的耐受性并提高了酶活，在40 g/L SDS溶液中，酶活提高了40%。

2.4 提高耐盐性和热稳定性

对高浓度盐的耐受性是工业用酶的重要特性，酶的耐盐性与一级结构中酸性氨基酸残基的大量存在有关。通过提高酶表面酸性氨基酸残基含量可以改善酶在高盐溶液中的稳定性，同时也能提高酶的热稳定性以及对碱性环境的耐受性[27]。Fang等[24]在截短KerSMD的C-端结构域后，酶的耐盐性和热稳定性都得到提升，在150 g/L的NaCl溶液中，酶活较野生型提高40%，60 ℃时酶活是野生型的1.7倍。Rajput等[28]通过互换B.licheniformis和B.pumilus角蛋白酶的前导肽，得到热稳定性提高、半衰期延长的角蛋白酶，KerBL在60 ℃以上是不稳定的，当KerBL的前导肽序列被KerBP的前导肽序列替换后，酶能耐80 ℃的高温，且半衰期达到45 min。

3 角蛋白酶高效表达菌株选育及发酵工艺

诱变和表达原件改造是获得角蛋白酶高效表达菌株常用的育种方法。Cai等[29]采用化学诱变法筛选到产角蛋白酶的Bacillussubtilis突变株，进一步优化培养条件后，角蛋白酶活提高到124.8 U/mL，比原菌株提高了83%。Zhang[30]将紫外辐照和亚硝酸钠诱变2种方式联合使用处理野生型B.subtilis，获得角蛋白酶活性提高75%的突变体。Radha等[31]将角蛋白酶基因启动子替换为木糖诱导型启动子，B.licheniformisMKU3的角蛋白酶活力提高到1 277 U/mL。Rao等[32]构建了用于蛋白表达的包括双启动子PykzA-P43及优化启动子Pdual3在内的一系列启动子。Xiao等[33]优化蛋白表达元件5′-UTR的二级结构，建立了一系列蛋白高效表达的5′-UTR序列。笔者所在课题组用上述表达元件在B.licheniformis中表达角蛋白酶，摇瓶中酶活提高了4倍，超过4 000 U/mL(数据未发表)。

角蛋白酶高效表达菌株的选育结合发酵工艺优化可以进一步提高酶的产量。碳源、氮源及生长底物对角蛋白酶的生产有很大影响。由于分解代谢物阻遏效应，葡萄糖、乳糖、麦芽糖等单糖和二糖以及易于同化的有机氮源(蛋白胨、氨基酸等)会抑制角蛋白酶的生产[16,34]。多糖(如淀粉)则对角蛋白酶的生产有促进作用[35]，向培养基中添加大豆粉做氮源能提高角蛋白酶的产量[36]。不同的生长底物亦明显影响角蛋白酶产量。B.amyloliquefaciensMA20 和B.subtilisMA21以羊毛为生长底物发酵产角蛋白酶时表现出显著的酶活性，两者酶活分别达到922和814 U/mL[37]。如以鸡毛为底物时，角蛋白酶的产量分别是B.licheniformis1 295 U/mL[38]、B.amyloliquefaciens610 U/mL[10]、B.cereus350 U/mL[39]、B.pumilus373 U/mL[12]以及B.subtilis319 U/mL[40]。B.subtilis以动物角粉为生长底物时，酶活达15 972 U/mL[41]；S.maltophilia以羊毛为生长底物时的酶活是1 728 U/mL[42]。Aspergillusoryzae以鸡毛为生长底物时，角蛋白酶活达到2 313 U/mL[43]。冒鑫哲等[44]通过优化培养基和发酵条件，B.subtilis摇瓶发酵24 h时角蛋白酶活性较优化前提高了4.26倍，且优化后的原料成本降低了96%。李光磊等[45]采用混合流加策略，优化毕赤酵母产角蛋白酶的发酵过程，使角蛋白酶产量达到2 048 U/mL。笔者所在课题组在前述菌株选育的基础上优化发酵条件后，摇瓶中角蛋白酶活较优化前提高2倍(数据未发表)。

4 角蛋白酶应用

角蛋白酶是重要的生物催化剂。角蛋白酶可以添加到洗涤剂中，降解蛋白质类污渍，增强去污效果；可以分解兽皮表面的毛发，用于皮革工业；可降解朊病毒的蛋白质外壳，用于医学领域[46]。角蛋白废弃物经角蛋白酶降解后的水解产物可以用于化妆品行业[47]，用作动物饲料、微生物培养基、有机肥料和土壤修复剂[48]，还可以从中分离活性肽和氨基酸[49](图1)。

图1 角蛋白酶的应用Fig.1 Applications of keratinase

4.1 农业应用

4.1.1 饲料原料

农业生产中产生大量的角蛋白废弃物，是良好的饲料蛋白来源。羽毛粉用作牲畜饲料添加剂有几十年历史了，传统的高压蒸煮法或化学降解法制造羽毛粉能耗大，角蛋白利用率不高[29]。羽毛经角蛋白酶水解，转化成氨基酸、肽、可溶性蛋白质等，既可提高角蛋白利用率，又避免了传统方法对环境的破坏[50]。单春乔等[51]以角蛋白酶水解羽毛粉制备可被动物消化吸收的肽类，在pH8.5条件下处理羽毛粉8 h，产物中70%以上为低聚肽。Adetunji等[48]以B.licheniformisLMUB05角蛋白酶降解羽毛得到的水解产物可以替代商用饲料并用于家禽的饲养。此外，角蛋白酶还可以直接添加到饲料中，帮助动物消化饲料蛋白，提高饲料的吸收利用率和营养价值[52]。

4.1.2 有机肥料和土壤修复剂

随着全球人口不断增长，人类对农产品和粮食的需求持续增加，土地被过度开发，大量使用化肥农药导致肥力丧失、产出下降，成为农业面临的严重问题。如何让土地恢复肥力、休养生息、实现可持续发展，是农业面临的重大课题。通过生物转化将角蛋白转变成缓释有机氮肥，可逐步提高土壤有机质含量，恢复肥力[53]。角蛋白经酶解制得有机肥可以促进植物生长、提高土壤保水性及土壤微生物活性[25,53]。角蛋白生物降解产物还能促进种子萌发[54]，为植物合成吲哚乙酸提供色氨酸前体并促进植物生长[55]。羽毛经Chryseobacteriumspp.发酵后可用作香蕉种植的氮肥[56]；经Aspergillusniger发酵后用于种植豇豆，能促进植物长高、增重、增单株叶数、增单株豆荚数、增产及提高抗病性[57]。

4.2 环保应用

4.2.1 皮革加工

传统皮革加工中的灰碱脱毛过程是污染最严重的环节，利用没有胶原蛋白水解活性的角蛋白酶代替灰碱用于兽皮脱毛，不仅条件温和、脱毛效果好、不伤皮质而且环境友好，是极有价值的皮革工业用酶[58]。角蛋白酶SCK6处理绵羊皮、山羊皮等，表现出优良的脱毛活性[59]。贾文睿等[59]用角蛋白酶32 ℃处理兔皮4 h，可以有效除去兔皮上的兔毛，并且兔皮和兔毛损伤小，均可回收利用。

4.2.2 绿色能源

能源短缺是全球面临的共同问题，人们积极寻求环保新能源。将废弃物生物转化为能源是解决能源问题的重要途径之一。羽毛经微生物降解后的副产物可以当燃料，如B.lichenifomis和Thermococcuslitoralis可发酵羽毛制备生物H2。产角蛋白酶的B.lichenifomis先水解羽毛成可溶性物质，T.litoralis进一步将可溶性物质转变成生物氢副产物[60]。羽毛在厌氧条件下经B.megaterium发酵后还可以生产甲烷[61]。由此可见，通过生物转化角蛋白废弃物制备能源是高效环保的方式。

4.2.3 废水处理及重金属回收

清洗草木灰的废水中有大量低密度悬浮物，难以清除。羽毛经角蛋白酶水解后可以制备絮凝剂用于此类悬浮物的沉降处理[62]。X光片的塑料基底上覆盖了一层被金属银饱和的凝胶层，在放射自显影后，X光片被废弃成为环境污染物。传统的回收金属银的方法昂贵且破坏环境，而角蛋白酶仅降解凝胶层，直接释放金属银并保持了塑料基底的完整性，是一种经济、环保的回收重金属银的方法[63]。

4.3 其他

纺织行业中羊毛和化纤混纺织物的旧物利用，必须将两种成分分开成单一成分才有回收利用的价值。通过角蛋白酶去除混纺织物中的羊毛成分，使织物成单一化纤成分回收，减少资源浪费[64]。在化妆品行业中，角蛋白酶用作脱毛产品的活性成分，角蛋白水解物用于皮肤保湿和痤疮护理及头发护理[47]。医药行业中用角蛋白酶处理医疗器械，消除阮病毒可能造成的污染[46]；灰指甲、牛皮癣等疾病的治疗中，用角蛋白酶预处理患处有助于药物渗透进病灶，获得更好的治疗效果[46]。

5 展望

角蛋白酶性质稳定，具有特异性水解难降解角蛋白的特性，使得该酶具有极大的应用价值，在农业、畜牧业、皮革工业、环保产业、新能源领域、化妆品行业以及医药行业中的应用越来越广泛。为了获得新的性能优良的角蛋白酶，如高活性、多功能、耐高温、耐极端pH、耐有机溶剂、耐盐、耐表面活性剂等特性，蛋白质工程技术正在发挥越来越大的作用。角蛋白酶高产菌株的选育和发酵工艺优化可为提高角蛋白酶单位产量、降低生产成本奠定基础，而新型角蛋白酶功能挖掘和应用技术开发使角蛋白酶的广泛应用成为可能，这将为缓解人类供需矛盾、人类与自然、人类与环境的矛盾做出贡献。