茶树LOX基因家族的鉴定及其在白茶萎凋过程的表达分析

林馨颖，王鹏杰，陈雪津，郭永春，谷梦雅，郑玉成，叶乃兴

茶树基因家族的鉴定及其在白茶萎凋过程的表达分析

林馨颖，王鹏杰，陈雪津，郭永春，谷梦雅，郑玉成，叶乃兴*

福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福建 福州 350002

脂肪族类化合物是植物芳香物质的重要组成部分，对白茶香气的形成具有重要作用。利用生物信息学方法，在染色体级别的茶树基因组数据库中，对基因家族进行鉴定，从中获得12个茶树基因家族成员，命名为～。12个茶树基因序列，主要定位于细胞质或叶绿体中，其编码蛋白具有相同的特征结构域及保守基序。系统进化树分析表明基因家族分为和两个亚家族，、、、为亚型，其余为亚型；基因结构分析表明含有8个外显子，其余均含有9个外显子；不同组织转录组数据分析结果表明，该家族在茶树嫩叶、成熟叶部位高表达；上游启动子区域分析发现大量与植物生长发育、光响应、激素及胁迫响应密切相关的顺式作用元件。荧光定量PCR检测发现，基因家族在干旱、低温及茉莉酸甲酯处理下均有不同程度的表达，在白茶不同萎凋时间处理下，、、、、、、和的表达量被诱导上调，4 h时表达量最高（最高上调27倍）。结果表明，基因家族成员参与白茶加工萎凋过程脂肪族香气形成的调控，为探明白茶加工过程香气形成的分子机制奠定基础。

茶树；基因；白茶萎凋；表达分析

脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）又称亚油酸氧化还原酶[1]，是植物脂肪酸代谢途径（LOX pathway）中的关键限速酶，专一催化含顺,顺-1,4-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸加氧反应，生成脂肪酸氢过氧化物（HPOs）[2]。LOX主要催化亚油酸（LA）和亚麻酸（LeA）在C9和C13位点发生加氧反应，分别生成9-HPOs和13-HPOs，根据氧化位点不同，可以分为9-LOX和13-LOX两种亚型[3]。LOX在植物中具有多重生理功能，可催化脂质降解、调控营养器官生长及响应生物和非生物胁迫反应[4]。已研究发现拟南芥（）中有6个基因[5]，葡萄（）中有18个基因（有5个为假基因）[6]，杨树（）中有21个基因[7]。

茶树[(L.) O. Kuntze]是我国重要的叶用经济作物之一[8]。香气是衡量茶叶品质的重要指标，香气物质主要通过脂肪酸、萜类和氨基酸等代谢途径合成，在茶叶加工过程中脂肪酸的氧化降解是茶叶香气形成的重要途径之一[9]。白茶是一类微发酵茶类，其加工过程主要包括萎凋和干燥工序。在白茶萎凋过程中，萜类物质、脂肪酸、挥发性香气物质等多种次级代谢物发生变化，对白茶色泽、滋味等品质因子产生一定影响[10]。基因不仅参与植物多种生物和非生物胁迫的防御反应，更是脂肪族类芳香物质生物合成的限制因子之一[11]。在茶叶加工过程中，脂氧合酶的反应底物亚麻酸、亚油酸经脂氢过氧化物裂解酶（HPL）、乙醇脱氢酶（ADH）等催化，最终被氧化降解形成小分子的醇、脂等化合物，形成茶叶芳香物质的主要组成成分[12]。因此作为该代谢通路的第一个关键酶，基因与茶叶香气品质形成相关[12]。

目前，茶树基因已有部分研究，Zhu等[9]利用茶树基因组数据库鉴定发现11条基因并对其特征及选择性剪接图谱进行研究；周子维等[13]对茶树基因家族成员的分子进化及密码子偏好性进行分析。茶树基因家族在染色体级别的茶树基因组中尚未被鉴定及研究，特别是在白茶萎凋过程中基因的表达分析未见报道。本研究以福鼎大白茶为供试材料，从茶树黄棪基因组中鉴定获得的12个基因。通过生物信息学和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析基因的生物信息学特征和在白茶萎凋过程中的动态表达，为研究基因对茶叶萎凋过程中香气形成作用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为2019年4月在福建农林大学南区教学茶园采集的福鼎大白茶（cv. Fuding Dabaicha）一芽二叶春梢。对试验材料进行萎凋处理，白茶萎凋工艺参照王鹏杰等[14]的方法：室内自然萎凋温度22～25℃，空气相对湿度70%～75%。分别收集0.100 g的鲜叶（萎凋处理0 h）和萎凋处理4、8、16、24、32、40、48 h的叶片。共采集8个样品，设3个生物学重复，用液氮快速冷冻后保存于–80℃冰箱备用。

对试验材料进行干旱、低温及茉莉酸甲酯（MeJA）处理，具体参考郭永春等[15]的方法，收集处理6、12、24、48 h后和对照（0 h未处理）的第二叶。每个处理3次重复，锡箔纸包裹标记，液氮速冻后保存于–80℃冰箱备用。

1.2 试验方法

1.2.1家族基因的鉴定及序列分析

下载茶树基因组数据库中的蛋白序列（https://www.plantkingdomdb.com/tea-tree），再在拟南芥基因组数据库（https://www.arabidopsis.org）下载拟南芥6个LOX蛋白序列，并以此为种子序列，在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）和茶树黄棪基因组数据库（https://bigd.big.ac.cn/gsa/index.jsp）进行BLAST-P比对，并获得同一性>90%且E值<10-10的所有茶树CsLOX家族成员的蛋白质序列。基因的结构域信息（PF01477和PF00305）下载自Pfam数据库（https://pfam.xfam.org），并使用HMMER软件进行鉴定[16]。此外，为验证所鉴定的茶树基因家族，在SMART（http://smart.embl-heidelberg.de）和CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）网站比对并进行确认分析。利用ExPASY（https://www.expasy.org）网站分析茶树LOX蛋白的理化性质，包括其基因组序列的编码序列、开放阅读框、分子量、等电点、蛋白质疏水性。利用在线工具WOLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp）进行亚细胞定位预测。并从茶树黄棪基因组注释结果（GSA: CRA003208，https://bigd.big.ac.cn/gsa/index.jsp）查询染色体位置并利用MapGen2Ch（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0）绘制染色体定位图谱。

1.2.2基因家族结构域序列比对和系统发育进化分析

为预测基因家族结构，采用DNAMAN 7.0软件和WebLogo（https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）在线软件分析基因家族的保守序列。从TAIR（https://www.arabidopsis.org）网站和Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）网站上下载拟南芥、水稻、葡萄的LOX氨基酸序列，与茶树基因家族成员进行多重序列比较。比对结果用MEGA 7.0软件构建系统进化树，校验参数Bootstrap值设置为1 000，其他为默认值[17]。

1.2.3基因结构分析和保守序列分析

从茶树基因组数据库中下载茶树外显子和内含子分布数据的存储文件，在GSDS2.0网站（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）绘制基因结构分布图[18]。使用MEME工具（http://meme-suite.org/tools/meme）对茶树LOX蛋白的保守基序进行分析，设置基序数量参数为5个，其余为默认[19]。

1.2.4基因家族的顺式作用元件分析

从茶树基因组中提取基因转录起始位置上游2 000 bp的序列进行查找启动子顺式作用元件，利用在线网站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）进行顺式作用元件预测分析[20]。

1.2.5基因组织特异性表达分析

基因组织特异性表达分析从中国核酸数据库（GSA）（https://bigd.big.ac. cn/gsa/index.jsp）下载茶树不同组织的转录组数据，包括芽、成熟叶、根、茎、嫩叶（GSA登录号CRA003208）[21]，使用Trim Galore软件过滤数据得到clean reads，将得到的转录组数据用Hisat2软件进行比对[22]，通过featureCounts软件[23]计算基因TPM值表达水平，最后对各转录组基因TPM值进行归一化处理并制作热图。

1.2.6 总RNA提取和qRT-PCR

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 茶树CsLOX基因家族的鉴定与染色体序列分析

经过分析和验证，最终获得12个家族成员，分别命名～。基因编码序列长度为2 253～2 766 bp，编码氨基酸数目为750～921。通过ExPASy软件包对蛋白序列进行分析发现，茶树CsLOX蛋白家族分子量在85.27～102.86 kDa，等电点为5.66～8.40，CsLOX均属于亲水性蛋白，CsLOX1、CsLOX5等电点大于7.0，为碱性蛋白，其余为酸性蛋白。亚细胞预测结果表明，CsLOX1、CsLOX2、CsLOX3、CsLOX4、CsLOX7和CsLOX12等6个成员定位于细胞质，CsLOX5、CsLOX6、CsLOX8、CsLOX9、CsLOX10和CsLOX11等6个成员定位于叶绿体（表2）。

由图1可知，12个茶树基因不均等分布于7条染色体（4、5、7、10、11、13、14号）上。4号染色体上有1个基因（），5号染色体上有3个基因（、、），7号染色体上有1个基因（），10号染色体上有1个基因（），11号染色体上有1个基因（），13号染色体上有1个基因（），14号染色体上有4个基因（、、、）。

2.2 CsLOX基因家族蛋白结构域组成及进化树分析

在SMART工具中提取的所有茶树基因家族成员特征结构域序列进行序列比对及logo分析（图2）。从图2可以看出，茶树家族中的所有基因都含有特征保守结构域，且该结构域由38个氨基酸残基组成，包括5个高度保守的组氨酸残基His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His，保守性较高。将茶树与拟南芥、水稻和葡萄的基因家族蛋白序列构建系统进化树（图3）。结果显示，茶树LOX蛋白与葡萄的LOX蛋白遗传距离较近，与水稻LOX蛋白距离最远。茶树的12个LOX蛋白与其他3种植物的LOX蛋白分类结果相似，也可根据脂氧合酶的氧结合位点进行分类，分成9-LOX和13-LOX两大类，其中CsLOX2、CsLOX3、CsLOX4、CsLOX7属于9-LOX亚型，其余8个均属于13-LOX亚型，茶树的13-LOX蛋白家族成员数量较多。茶树的8个13-LOX家族成员聚为2个分支，其中一个分支由CsLOX1、CsLOX5和CsLOX6组成，与葡萄的VvLOX1、VvLOX8、VvLOX13蛋白、拟南芥的AtLOX1、AtLOX3、AtLOX4蛋白、水稻OsLOX2、OsLOX10蛋白聚成一支。其余蛋白聚为为一支。遗传距离越近，表明蛋白结构和功能更为相似，茶树的LOX蛋白功能可能与葡萄、拟南芥和水稻的特定LOX蛋白具有相似的生理作用。

2.3 CsLOX家族基因结构及保守基序分析

采用GSDS2.0在线工具比较茶树基因家族的内含子和外显子（图4），在12个基因结构中，除了CsLOX1外显子数量为8，其余均为9。家族基因组序列最长的是，长度超过25 kbp。为了进一步探究茶树基因家族序列的保守性，利用MEME对鉴定到的12个基因家族进行保守基序鉴定，如图5所示，12个基因均含有基序1～5。由此可见，基因家族保守性高，稳定性好。

表2 茶树CsLOX基因家族的序列特征

图1 CsLOX家族基因在茶树染色体上的分布

注：A：纵坐标为氨基酸序列堆叠的高度，表示该位置处的序列保守性；横坐标为氨基酸序列排列的顺序，表示该位置的每个氨基酸的相对频率；B：利用DNAMAN7.0软件对保守结构域进行对齐

注：AtLOX：拟南芥；OsLOX：水稻；VvLOX：葡萄；CsLOX：茶树

图4 茶树CsLOX基因结构分析

注：A：茶树LOX家族系统进化树；B：茶树LOX家族保守基序分布；C：基序logo分析

2.4 CsLOX基因顺式作用元件分析

为了研究茶树基因顺式作用元件的功能，用其转录起始位置上游2 000 bp的序列查找各类顺式作用元件，共鉴定出28种顺式作用元件，包括生长作用顺式元件4种、激素响应顺式元件7种、胁迫响应顺式元件4种及光响应顺式元件13种。重点对基因启动子中的生长作用顺式元件、激素响应顺式元件和胁迫响应顺式元件进行分析（图6），基因启动子的顺式调控元件中，光响应顺式元件最多：MRE、BOX4、GATA-motif、GT1-motif、G-BOX、G-box、TCT-motif、I-box、GA-motif共9种，113个；响应激素的顺式元件包括脱落酸响应元件（ABRE，22个）、茉莉酸甲酯响应元件（CGTCA-motif，6个；TGACG-motif，6个）、水杨酸响应元件（TCA-element，6个）、生长素响应元件（TGA-element，3个）、赤霉素响应元件（P-box，5个；GARE-motif，5个）；生长作用元件包括调控分生表达组织元件（CAT-box，8个）、调控玉米醇溶蛋白代谢元件（O2-site，6个）、参与昼夜节律调控元件（Circadian，1个）、参与表达调控元件（MotifI，1个）和干旱响应元件（MBS，2个）、厌氧诱导响应元件（ARE，25个）和防御和应激响应元件（TC-rich，10个）、低温响应元件（LTR，1个）。这些结果预示了茶树基因家族在茶树生长发育及响应光照、激素和胁迫中存在一定的作用。

2.5 CsLOX基因在不同组织中的表达模式

为了研究基因家族在茶树生长发育过程中的表达模式，从网上下载茶树5个组织（芽、成熟叶、根、茎、嫩叶）的转录组，分析12个基因在茶树这5个组织中的表达模式（图7）。结果表明，在茶树芽、成熟叶、根、茎、嫩叶中表达量均较低，其他成员在各个组织均有不同程度的特异性表达。嫩叶与成熟叶作为茶树重要的部位，具有重要作用，而、、在嫩叶中具有较高表达，、、、、在成熟叶中有较高表达，基因家族在茶树组织中具有重要作用。总体来看，茶树基因家族在茶树茎中几乎不表达；在根中除了、有较高表达量，其余茶树基因表达量较少。

2.6 不同胁迫处理对CsLOX基因表达的影响

为研究基因家族在逆境下的作用，对12个基因进行qRT-PCR，对其在MeJA激素（图8）、低温（图9）和干旱（图10）处理条件下的表达量进行分析。

基因家族在MeJA激素处理条件下，以0 h处理下的基因表达量为对照，、、、在所有时间点表达量均显著上调，其中在24 h表达量上调达到最高22倍，在24 h表达量上调达13倍。、、在所有时间点上表达量均显著下调。在12 h和48 h表达量显著上调，在48 h显著下调，其余时间点均显著上调，在6 h和24 h表达量显著上调。在24 h表达量显著上调，达4倍。

注：颜色刻度表示log2转换后的值，红色代表高表达，蓝色代表低表达

注：不同小写字母表示同一基因在不同组织中的表达差异（P<0.05）。下同

图9 低温胁迫下茶树CsLOX基因家族表达分析

基因家族在低温胁迫下，以0 h处理下的基因表达量为对照，在24 h表达量显著上调，在4个时间点表达量均下调，在12 h时显著下调，在12、48 h时显著下调。、、、和在6、12、24 h及48 h这4个时间点的表达量均上调，其中在24 h时上调近20倍。在6 h和24 h表达量显著上调；在12 h时表达量显著下调，其余3个时间点显著上调；在6 h显著上调，其后的时间点呈逐步降低的趋势，并在48 h时显著下调；在6 h和24 h表达量显著上调。

基因家族在干旱处理下，以0 h处理下的基因表达量为对照，在24 h和48 h表达量显著下调；在4个时间点表达量均显著上调，其中在48 h时表达量上调近20倍。在48 h表达量显著下调，在24 h表达量显著下调，在6 h表达量显著下调，后逐步增加，48 h时达显著上调。、、和在4个时间点表达量均显著下调。在6 h时显著下调后逐步上调，但为达到显著水平。在6 h时表达量上调2倍。

2.7 白茶萎凋过程中CsLOX基因表达的变化规律

通过qRT-PCR对基因在白茶萎凋处理0、4、8、16、24、32、40、48 h后的表达水平进行分析，其中以0 h的处理为对照（图11）。研究发现，在白茶不同萎凋时间点，12个茶树的基因均被诱导表达，但有不同时间点存在一定的差异。、、等3个基因表达均呈下调趋势，、、、、、、、等8个基因在4 h表达均呈上调趋势，其中，在4 h时表达量最高，高达对照表达量的27倍，其次为、、。

3 讨论

本研究通过茶树黄棪基因组数据分析得到12个基因，其中13-LOX亚型家族成员8个，9-LOX亚型家族成员4个。通过对基因家族蛋白信息和基因结构进行系统地分析发现，茶树CsLOX蛋白序列均含有一段由38个保守氨基酸构成的序列His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His，这个结构域是脂氧合酶潜在的与非血红素铁结合的位点，在维持脂肪酸氧合酶的结构稳定性上起着至关重要的作用[25]。在杜仲基因家族的研究中发现，13-LOX亚型易以基因簇形式分布，表明基因进化过程中发生了复制，形成串联重复，基因复制具有重要作用，可产生新基因并发生亚功能化或新功能化[26]，在茶树基因家族染色体序列及基因结构分析中也有同样发现。对外显子和内含子进行研究，有助于了解基因在结构和功能上的差异，茶树基因家族内含子、外显子数量几乎一致，说明是一种高度保守的基因，这与在拟南芥、葡萄基因中的研究结果一致[5-6]。

图10 PEG胁迫下茶树CsLOX基因家族表达分析

图11 CsLOX基因在不同萎凋时间处理下的表达分析

许多研究表明，基因可在植物生长发育过程中发挥作用。通过对茶树不同组织转录数据分析表明，基因家族在茶树叶片（成熟叶、嫩叶）表达量较高，在芽、根中部分基因表达，在茎中几乎不表达，该结果与Zhu等[9]在茶树基因中的研究一致。此外，在茶树基因启动子区域的分析中发现CAT-box、O2-site等与分生组织表达调控相关的响应元件，说明了基因家族在茶树生长发育中有重要作用。基因在植物器官（包括根、茎、芽、叶、花、果实等）和细胞器（包括液泡、叶绿体、细胞质、脂球体和胞浆等）中具有广泛分布的特点，其存在部位的不同可能意味着功能差异[27]。定位于细胞质的调控了马铃薯块茎发育[27]和拟南芥侧根形成[28]。此外，定位于叶绿体的在番茄果实成熟衰老进程中，对脂肪族类香气物质的形成以及逆境条件下叶片组织中JA生物合成过程都具有作用[29]。基因的亚细胞定位预测结果表明，主要存在于叶绿体、细胞质中，这暗示了基因与茶树脂肪族类香气物质形成有关。

迄今为止，白茶萎凋过程中萜类合成酶等与香气形成相关基因研究较多，如、和等在萎凋过程0～4 h和16～24 h表达量呈上升趋势，单萜类化合物得到快速积累[30]，而对于脂肪族类香气物质形成的分子机理研究较少。已有研究表明，是脂肪族类香气物质合成的主要限制因子之一，属于多基因编码的一类酶，但并非所有的基因家族成员都参与芳香物质的形成[11]。目前，通过对挥发性物质与基因表达的关联分析发现，猕猴桃中的和与己醛、己烯醛的合成相关[31]；在桃果实芳香物质研究中发现，和与内脂含量相关，而和与C6醛的合成相关，参与合成芳香性挥发物质[32]。前人研究发现，茶叶加工过程中作为脂肪酸氧化降解过程中的第一个关键酶，基因与茶叶香气品质形成相关[12]。Fu等[33]以金萱品种春梢的一芽三叶为材料，探究发现不同光质处理下，鲜叶萎凋后基因表达发生不同变化。王阳明等[34]对茶树酶学特性研究发现基因通过对酶类的催化生成一系列脂肪族类香气物质。本研究发现，在白茶萎凋过程中基因家族表达也类似表达，、、、、、、、这8个基因在萎凋历时4 h时表达量达到最高点（最高上调27倍），而其他基因表达并非如此。由此表明，茶树基因家族并非所有成员参与白茶脂肪族类香气的形成，而是部分基因在某个时间点表达量上调，促进白茶萎凋过程香气物质形成。

前人在茶树组转录组中鉴定到11个基因，发现其中5个成员在病虫害胁迫下表达水平上调，3个成员在低温胁迫下表达水平升高，3个成员在MeJA处理后表达水平上升，表达上调高达117倍[9]。本研究通过对基因家族在干旱、低温及MeJA处理，发现基因有不同程度的上调或下调表达，干旱胁迫下最高上调20倍，低温胁迫下最高上调20倍，MeJA激素处理下最高上调22倍。并通过对茶树基因启动子区域分析发现大量与激素及胁迫响应调控相关的顺式元件，尤其是乙烯、赤霉素、脱落酸等激素响应元件和低温、干旱等非生物胁迫元件，这预示基因家族可能通过各种激素信号转导途径参与胁迫响应过程。

本研究在染色体级别的茶树基因组数据中鉴定出12个基因，对基因进行系统发育进化、基因结构分析、启动子顺式元件分析及qRT-PCR分析白茶萎凋不同时间点的表达情况，推测在白茶萎凋过程中基因家族成员参与脂肪族类香气形成，为阐明白茶加工过程中脂肪族香气形成的分子机制奠定基础。

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Identification ofGene Family inand Expression Analysis in the Process of White Tea Withering

LIN Xinying, WANG Pengjie, CHEN Xuejin, GUO Yongchun, GU Mengya,ZHENG Yucheng, YE Naixing*

College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science at Universities in Fujian,Fuzhou 350002, China

Aliphatic compounds are an important part of plant aromatic substances and play an important role in the composition of white tea aroma. This study used bioinformatics methods to identify thegene family in the chromosome-level tea plant genome database, and obtained 12 tea plantgene family members, named-. The 12 tea plantare mainly located in the cytoplasm or chloroplast. The encoded proteins have the same characteristic domains and conserved motifs. Phylogenetic tree analysis shows that thegene family is divided into two subfamilies: 9-LOX and 13-LOX.,,, andbelong to 9-LOX subtypes, and the rest belong to 13-LOX subtypes. Gene structure analysis shows thatcontains 8 exons, the rest contain 9 exons. The transcriptome data analysis of different tissues shows that the family genes are highly expressed in the tender and mature leaves of tea plants. The upstream promoter region analysis finds a large number of-acting elements closely related to plant development, light response, hormone and stress response. Fluorescence quantitative PCR detection reveals that thegenes were expressed to varying degrees under drought, low temperature and MeJA hormone treatment. Under the treatment of different withering time of white tea, the expression levels of,,,,,,andwere induced, with the peaks at 4 h (up to 27-fold increase). The results of this study show that members of thegene family participate in the regulation of the formation of aliphatic aromas during the process of white tea withering, laying a foundation for understanding the molecular mechanism of aroma formation during tea processing.

,gene, white tea withering, expression analysis

S571.1；Q52

A

1000-369X(2021)04-482-15

2020-11-17

2021-01-09

福建农林大学茶产业链科技创新与服务体系建设项目（2020-01）、福建农林大学科技创新专项基金（CXZX2017181）、福建张天福茶叶发展基金会科技创新基金（FJZTF01）

林馨颖，女，硕士研究生，主要从事茶树栽培育种与生物技术研究，12565769@qq.com。*通信作者：ynxtea@126.com

（责任编辑：赵锋）