茶谷蛾成虫触角转录组及嗅觉相关基因分析

龙亚芹，罗梓文，王雪松，龙丽雪，玉香甩，李金龙，曲浩，汪云刚，陈林波

茶谷蛾成虫触角转录组及嗅觉相关基因分析

龙亚芹，罗梓文，王雪松，龙丽雪，玉香甩，李金龙，曲浩，汪云刚，陈林波*

云南省农业科学院茶叶研究所/云南省茶树种质资源创新与配套栽培技术工程研究中心/云南省茶学重点实验室，云南 勐海 666201

为筛选茶谷蛾嗅觉相关基因，采用IlluminaHiSeq 4000高通量测序平台分别对茶谷蛾雌雄成虫触角进行转录组测序及生物信息学分析，共获得茶谷蛾触角转录组37 708条unigenes。通过同源性比对，在NR数据库成功注释16 027条unigenes；有11 701条unigenes得到GO注释，根据其功能可分为细胞组分、分子功能和生物过程三大类40亚类；有6 047个unigenes得到KOG注释，按照功能分为25类；根据KEGG数据库，有12 009条unigenes注释到283个通路。根据注释信息，挖掘到238个候选嗅觉相关基因，包括108个气味结合蛋白基因，55个气味/嗅觉受体基因，26个味觉受体基因、25个离子型受体基因、11个化学感受蛋白基因、4个感觉神经元膜蛋白基因、4个感官知觉基因、4个化学感受受体基因和1个气味降解酶基因。通过基因差异表达分析，筛选出12个气味结合蛋白基因、9个气味/嗅觉受体基因、4个信息素结合蛋白、3个味觉受体基因、1个化学感受蛋白基因和1个离子型受体蛋白基因。本研究获得了茶谷蛾触角转录组数据，并鉴定出候选嗅觉相关基因，为进一步研究茶谷蛾的基因功能及嗅觉感受机制奠定分子基础。

茶谷蛾；触角转录组；高通量测序；基因注释；嗅觉相关基因

茶谷蛾（），又名茶灰木蛾，鳞翅目谷蛾科，是茶树重要的食叶害虫之一。在我国台湾、海南、广东、福建曾有茶谷蛾发生的记录，在印度等地一度为茶树主要害虫[1-2]。茶谷蛾幼虫吐丝缀叶成苞，隐藏于苞内咀食成熟叶片叶肉，暴食期甚至能将成熟叶、嫩枝树皮一并吃光，对产量和树势造成巨大影响。近几年茶谷蛾在云南部分茶区发生极其严重[3]。茶谷蛾幼虫隐蔽性强，隐匿在叶苞内取食，受惊吓或干扰后，立即落入地面或其他隐蔽场所，除人工采虫外，目前缺乏有效的防控措施，迫切需要寻求新的防治方法。

嗅觉是昆虫寄主定位、取食、求偶、交配以及寻找产卵场所、躲避敌害等各种行为活动的基础，对其种群生存、繁衍有着重要的作用[4-5]。昆虫嗅觉系统的主要器官是触角，触角上着生有许多的嗅觉感受器且有各种嗅觉蛋白，参与对外界气味化合物的识别进而调控昆虫的行为活动[6-7]。研究表明，嗅觉系统中存在许多蛋白，参与完成昆虫嗅觉识别过程，主要包括气味结合蛋白（Odorant binding proteins，OBPs）、嗅觉/气味受体（Olfactory/odorant receptors，ORs）、化学感受蛋白（Chemosensory proteins，CSPs）、离子型受体（Ionotropie receptors，IRs）、味觉受体（Gustatoryreceptors，GRs）和昆虫感觉神经元膜蛋白（Sensoryneuron membrane proteins，SNMPs）等。目前在13种鳞翅目昆虫家族中的35种昆虫中发现超过150种OBPs[8]，随着对其研究的不断深入，多种昆虫如光肩星天牛[9]、茶尺蠖[10-11]、苹果蠹蛾[12]等开展了嗅觉相关蛋白种类、功能及嗅觉机制研究。昆虫的嗅觉相关蛋白是未来害虫防治的潜在靶标[13-15]。因此，对茶谷蛾嗅觉相关基因进行深入研究，可以揭示茶谷蛾的嗅觉行为反应，进而为茶谷蛾引诱剂或趋避剂研制提供理论依据，也可为茶谷蛾的综合防控提供新思路。

高通量测序技术的快速发展极大地促进了昆虫基因组、转录组，特别是非模式昆虫转录组学方面的研究。目前，该技术被成功地应用于多种昆虫，如大蜡螟[16]、亚洲玉米螟[17]、草地贪夜蛾和斜纹夜蛾[18]、云斑天牛[19]、七星瓢虫[7]、绿豆象[6]等，筛选出昆虫中大量与嗅觉相关的基因，为深入研究嗅觉相关基因功能奠定了基础。本研究采用高通量测序技术对茶谷蛾成虫触角转录组进行测序，并通过生物信息学方法对其基因功能注释，挖掘嗅觉相关基因，研究结果可为今后开展茶谷蛾的行为调控和生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

茶谷蛾为云南省农业科学院茶叶研究所室内饲养2代以上成虫，羽化后选取未交配的雌雄茶谷蛾成虫各100头，分别将雌雄虫触角剪下，经液氮速冻后保存于–80℃超低温冰箱备用。

1.2 样品RNA的提取与检测

使用Trizol法分别提取雌雄茶谷蛾触角RNA，利用NanoDrop对RNA的纯度进行检测，采用Qubit2.0对RNA的浓度进行定量，并用Agilent 2100精检RNA的完整性，以保证样品RNA的质量，转录组测序分析由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 cDNA文库构建与测序

取检测合格的RNA样品，用带有Oligo（dT）的磁珠富集测序样品中的mRNA，随后加入fragmentation buffer将mRNA进行随机打断；以打断的mRNA为模板，用六碱基随机引物（Random hexamers）合成第一链cDNA；随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链，用AMPure XP beads纯化双链cDNA；纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选250～300 bp左右的cDNA，再进行PCR扩增，并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物获得文库。使用Qubit2.0对文库进行初步定量，稀释文库至1.5 ng·μL-1，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测，插入片段符合预期后，利用qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量，以保证文库有效浓度高于2 nmol·L-1。库检合格后，使用高通量测序平台IlluminaHiSeq 4000测序。

1.4 转录本的拼接组装及完整性评估

对原始图像数据文件经CASAVA碱基识别（Base calling）分析转化为原始测序序列raw reads，进行过滤，去除带接头的Reads、N（N表示无法确定碱基信息）、低质量Reads（质量值Qphred≤20的碱基数占整个Reads的50%以上的Reads），得到clean reads。采用Trinity软件对clean reads进行组装拼接[20]，获得高质量的茶谷蛾触角的unigenes库。

1.5 转录组数据分析及嗅觉相关基因鉴定

将获得的茶谷蛾unigenes序列与NCBI蛋白数据库（NCBI non-redundant protein sequences，NR），NCBI核酸序列数据库（NCBI non-redundant necleotide sequences，NT），Swiss-Prot数据库（A manually annotated and reviewed protein sequence database），基因本体论（Gene ontology，GO），京都基因与基因组（KEGG ortholog database，KO），蛋白家族（Protein family，Pfam）和直系同源基因簇（Clusters of orthologous groups of proteins，KOG/COG）七大数据库进行比对，获得相应的unigenes注释信息，再利用诺禾致源售后服务NovoMagic平台，通过关键词筛选嗅觉相关基因。

1.6 差异表达基因分析

为了比较嗅觉相关基因在雌、雄茶谷蛾成虫触角之间表达量的差异，利用RSEM软件对bowtie的比对结果进行统计，采用FPKM值对基因表达量进行评估[21]，对无生物学重复，选用edgeR软件来进行基因表达差异显著性分析[22]，差异基因筛选标准为|log2(FoldChange)|>1或者q value<0.005。

2 结果与分析

2.1 茶谷蛾触角转录组测序统计与数据组装

利用Illumina测序平台对茶谷蛾雌、雄触角2个样本转录组进行测序，测序统计如表1所示，从测序得到reads考察其碱基质量值可以看出，雌、雄茶谷蛾触角样品碱基质量值超过Q30的碱基所占比例均高于92%，说明本次转录组测序质量较好，可信度高。从茶谷蛾雌触角转录组中获得22 532 189条raw reads，Q20和Q30准确度分别为97.47%和92.64%，其序列的GC碱基占总碱基数比例为40.24%；雄触角转录组中获得23 301 776条raw reads，Q20和Q30准确度分别为97.47%和92.56%，其序列的GC碱基占总碱基数的比例为37.89%（表1）。采用Trinity软件对clean reads拼接组装，获得unigenes数为37 708条，将其作为后续分析基因，其长度在301～500 bp的有12 987条，501～1 000 bp的有10 655条，1 001～2 000 bp的有7 118条，大于等于2 001 bp的有6 948条，平均长度为698 bp，N50长度值为2 147，N90长度值为489（表2），说明组装完整性较好。

2.2 茶谷蛾触角unigenes基因功能注释

将拼接后的unigenes序列分别在NR、NT、KO、Swiss-prot、PFAM、GO和KOG/COG数据库中进行功能注释，结果表明，雌、雄成虫触角转录组在所有数据库中注释成功的基因分别为2 871（9.20%）、2 846条（7.61%）；至少在一个数据库里注释成功的基因分别为19 292条（61.84%）、21 598条（57.79%）。雌、雄成虫触角转录组数据注释到NR数据库的基因数目最多，分别为15 209条（48.75%）、17 011条（45.51%）；KOG数据库注释基因最少，分别为5 959条（19.10%）、6 285（16.81%），详见表3。

表1 茶谷蛾触角转录组测序统计

注：CGEC为茶谷蛾雌成虫，CGEX为茶谷蛾雄成虫。Q20：质量值≥20的碱基所占百分比，Q30：质量值≥30的碱基占比

Note: CGEC is female. CGEX is male. Q20: Percentages of bases with the quality value≥20. Q30: Percentages of bases with the quality value≥30

表2 茶谷蛾触角转录组组装结果

表3 茶谷蛾基因注释成功率统计

2.3 同源比对

将茶谷蛾触角转录组所有unigenes序列在NCBI中的NR蛋白数据库进行BLASTx比对，结果16 027个unigenes（42.50%）有BLASTx比对结果。根据NR数据库注释结果，进一步对这些注释序列的同源物种进行统计（图1），茶谷蛾触角注释的基因序列与海波斯莫科马属蛾（）相似基因最多，占15.20%、其他依次为亚洲玉米螟（）占11.20%、大蜡螟（）占7.90%、棉铃虫（）占6.90%、粉纹夜蛾（）占6.30%，其他物种占52.50%。

2.4 茶谷蛾触角unigenes基因功能分类

茶谷蛾触角转录组共有37 708条unigenes，其中在GO数据库中注释到11 701条（图2），分为3个大类和40个亚类，3个大类包括生物进程、细胞组分和分子功能。生物进程中参与细胞过程的unigenes数量最多（6 729条），其次为代谢过程（5 692条）；细胞组分中参与细胞解剖实体的unigenes数量最多（5 257条），其次是细胞部分内（2 897条）；分子功能中参与结合和催化活性的unigenes数量最多，分别有6 221条和4 435条（图2）。

将茶谷蛾触角转录组unigenes与KOG数据库进行比对并根据其功能进行分类统计（表4），6 047个unigenes得到注释，按照功能分为25类，其中一般功能预测最多，有1 040个，其次是信号转导机制，有822个；细胞运动最少，有16个。

茶谷蛾转录组有7 892条unigenes注释KEGG代谢通路，被分为3个层次，第一层次分为五大类，即细胞加工、环境信息处理、遗传信息处理、代谢和有机体系统，第二层为34小类（表5），第三层次为283个代谢途径分支。涉及与茶谷蛾信号转导的有973条、信号分子与相互作用相关的有123条，涉及到环境适应108条，感觉系统93条。这些unigenes为今后深入开展茶谷蛾环境适应性研究奠定了基础。

2.5 茶谷蛾触角转录组嗅觉相关基因分析

通过诺禾致源售后服务NovoMagic平台，采用关键词搜索和注释基因分析，从茶谷蛾触角转录组数据中，鉴定出238个候选嗅觉相关基因（表6）。其中，气味结合蛋白基因108个，占比达45.4%、气味/嗅觉受体基因55个、味觉受体基因26个、离子型受体基因25个、化学感受蛋白基因11个、神经元膜蛋白基因4个、感官知觉基因4个、化学感受受体基因4个、气味降解酶基因1个，各基因占比见表6。

图1 NR数据库中注释的茶谷蛾unigenes

图2 茶谷蛾触角转录组GO分类图

表4 茶谷蛾触角转录组的KOG系统分类

表5 茶谷蛾触角转录组的KEGG分类

表6 茶谷蛾触角转录组嗅觉相关基因

2.6 茶谷蛾雌雄成虫触角差异表达基因分析

通过对茶谷蛾雌雄虫触角差异表达基因进行分析，共有1 307个差异基因，其中上调基因474个，下调基因833个（图3）。为进一步了解嗅觉相关基因在雌、雄茶谷蛾触角中的表达情况，共鉴定出30个与嗅觉相关的差异表达基因（DEGs），其中20个基因在茶谷蛾雄虫中上调表达，包括4个信息素结合蛋白基因、7个气味结合蛋白基因、5个气味/嗅觉受体基因、3个味觉受体基因以及1个化学感受蛋白基因；下调表达10个，包括5个气味结合蛋白基因、4个气味/嗅觉受体基因和1个离子型受体基因（表7）。由此可见，雌、雄茶谷蛾成虫对外界气味化合物的识别存在差异。

注：CEGC：雌性茶谷蛾，CGEX：雄性茶谷蛾

表7 茶谷蛾嗅觉相关基因表达模式

续表7

3 讨论

高通量测序技术已成为一种重要的生物学研究手段，开展昆虫转录组测序，可以获得大量的序列信息，对于很多没有完整基因组数据的昆虫来说，可直接解决分子生物学试验中的无参基因这一重要难题[23-25]。本研究通过Illumina HISeq 4000高通量测序平台对茶谷蛾雌雄成虫触角进行转录组测序和功能分析，共获得37 708条unigenes，平均长度为698 bp，其样本数据的Q30碱基比例大于90%，而N50长度为2 147 bp，据报道N50长度值越大表示序列拼接的完整性越好[26]，说明本研究获得的测序数据质量较好，保证了后续分析的准确性和可靠性。对unigenes功能注释发现，有16 027条unigenes在NCBI蛋白数据库（NR）成功注释，11 701条unigene在基因GO数据库得到注释，12 009条unigenes得到KEGG富集，归属于283个通路，与大多数研究结果相似[16,18]。其中茶谷蛾触角unigenes序列与鳞翅目昆虫海波斯莫科马属蛾、玉米螟、大蜡螟、棉铃虫、粉纹夜蛾的基因序列相似度高，表明茶谷蛾触角基因可能与鳞翅目昆虫基因具有相似的功能。

嗅觉系统对于昆虫的生长和生殖至关重要，是昆虫对外界信号进行识别、传递并作出相应行为的重要器官，系统中涉及多种蛋白家族[27-29]。本研究利用生物信息学手段，从茶谷蛾成虫触角转录组数据库中共鉴定出9类嗅觉相关基因238个，其中气味结合蛋白基因108个（包括信息素结合蛋白、普通气味结合蛋白和触角结合蛋白3类），数量最多；其次是气味/嗅觉受体基因55个，包括典型气味受体和非典型气味受体。另外，还包括26个味觉受体基因、25个离子型受体基因、11个化学感受蛋白基因、4个神经元膜蛋白基因、4个感官知觉基因、4个化学感受受体基因和1个气味降解酶基因。这些基因在昆虫嗅觉感受过程中都起到关键性的作用[30]。与其他已知的鳞翅昆虫如大蜡螟触角转录组中鉴定获得226个候选嗅觉相关基因[20]、草地贪夜蛾转录组中鉴定到233个和斜纹夜蛾中鉴定到217个嗅觉相关基因数量相比[18]，本研究获得茶谷蛾嗅觉基因数量处于合理范畴。

此外，通过基因差异表达分析，初步鉴定出30个嗅觉相关基因在雌雄茶谷蛾触角中差异表达，其中4个信息素结合蛋白基因，在雄虫中为上调表达；气味结合蛋白基因12个，在雄虫中7个上调表达，5个下调表达；3个味觉受体基因和1个化学感受蛋白基因在雄虫中上调表达；9个气味/嗅觉受体基因，5个为上调表达，4个为下调表达；1个离子型受体基因在雄虫中下调表达。这些结果表明，雌、雄茶谷蛾成虫对外界气味化合物的识别存在差异，同时这些嗅觉差异表达基因可能在茶谷蛾性信息素识别过程中发挥着重要作用，可以作为潜在的干扰茶谷蛾嗅觉识别的靶标基因，为后续茶谷蛾化学生态学分子机制的深入研究提供足够的数据支持和参考依据。

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Analysis of the Antennal Transcriptome and Olfactory-related Genes in the

LONG Yaqin, LUO Ziwen, WANG Xuesong, LONG Lixue, YU Xiangshuai, LI Jinlong, QU Hao, WANG Yungang, CHEN Linbo*

Tea Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Technology Engineering Research Center of Tea Germplasm Innovation and Supporting Cultivation/Yunnan Provincial Key Laboratory of Tea Science, Menghai 666201, China

To identify the olfactory-related genes, the transcriptome analysis of thewas performed using Illumina HiSeq 4000. Through sequence alignment, 16 027 unigenes were annotated in NR databases. Totally 11 701 unigenes were annotated in GO database, which can be divided into 3 groups according to their functions: cellular component, molecular function and biological process. Totally 6 047 unigenes were further annotated and divided into 25 functional groups in KOG databases. KEGG pathway analysis shows that 12 009 unigenes were annotated into 283 metabolism pathways. According to the annotation information, 238 candidate olfactory-related genes were obtained including 108 odorant binding protein () genes, 55 odorant /olfactory receptor () genes, 26 gustatory receptor () genes, 25 ionotropic receptor () genes, 11 chemosensory protein () genes, 4 sensory neuron membrane protein () genes, 4 sensory perception () genes , 4 chemosensory receptor () genes and an odorant degrading enzyme () gene. It was found that 12 odorant binding protein genes, 9 odorant/olfactory receptorgenes, 4 pheromone binding protein genes, 3 gustatory receptor genes, chemosensory protein gene and 1ionotropic receptor gene were differentially expressed in the antenna of. In this study, the identification of candidate olfactory-related genes laid a molecular foundation for further studies on gene function and olfactory perception mechanism of the.

, antennal transcriptome, high-throughput sequencing, genome annotation, olfaction-related genes

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2021)04-553-11

2020-10-10

2020-11-26

国家重点研发计划（2016YFD0200903）、财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系（CARS-19）

龙亚芹，女，副研究员，主要从事茶树病虫害研究，longyaqin19831212@126.com。*通信作者：chenlinbo2002@sina.com

（责任编辑：赵锋）