现代分析技术在储粮微生物鉴定中的研究进展*

王 锦 陈晋莹 陈 帅 李 理

(中储粮成都储藏研究院有限公司 610091)

粮食是国家的战略物资，是人民的生活必需品，是保障社会经济稳定和发展的基础。我国不仅是世界粮食生产、消费大国，也是粮食储运量最多的国家之一，粮食的安全生产和储藏，关系国计民生，是粮食工作的重中之重。粮食因其含有丰富的碳水化合物、蛋白质、脂肪及无机盐等营养物质，常成为微生物生长的天然培养基。世界上各地所产的粮食、粮食加工产品以及饲料上都有大量的微生物存在，包括病毒、细菌、放线菌、真菌等[1]。在合适的温度和湿度条件下，这些微生物的生命活动将对储藏粮食的品质产生影响，出现变色、发霉、发热等症状。特别是微生物中的霉菌，具有生长繁殖能力强的特点，可直接或间接的利用粮食中各种营养物质，分泌产生多种生物酶，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，将粮食中的营养成分转化为自身生长繁殖所需的小分子营养成分，进行代谢活动，使粮食品质发生劣变，严重影响粮食的价值[2]。有些霉菌，如黄曲霉菌(Aspergillisflavus)、青霉菌(Penicillium)、镰刀菌(Fusarium)等还能在粮食中产生多种真菌毒素。被真菌毒素污染的粮食及其制品通过食物链对人类和动物的健康产生危害，给食品工业、饲料工业和畜牧业生产造成了巨大的危害[3，4]。因此储粮微生物的快速鉴定是进行储粮微生物综合防治的前提和基础。

微生物具有个体微小、结构简单、用肉眼难以分辨的特点。传统的微生物分类和鉴定方法主要是以微生物的形态学和生理生化等特征为依据。虽然这类方法仍被广泛使用，并能为储粮的安全性提供一定的指示，但是其只适用于可以体外培养的生物体，且存在检测操作技术专业性强，要求高，操作程序繁琐、时间长，检测精度低等问题，难以满足对储粮微生物快速、准确鉴定的需求。随着分子生物学技术、质谱技术等相关技术的飞速发展，许多不依赖于活的培养物的现代方法逐渐被应用到微生物的分析与鉴定中，满足了不同储粮微生物和检测条件的需求[5]。本文中，主要针对储粮微生物检测和鉴定的现代分析技术研究进展进行了阐述。

1 生化分析方法用于微生物鉴定

在微生物学中，传统的生化鉴定方法主要依靠微生物培养过程中利用物质的能力，代谢产物的特殊性，与温度和氧气的关系等特征进行鉴定。这类方法费时费力(培养基制备、稀释、平板培养、计数、分离和表征)，结果至少3 d后(霉菌7 d)才能观察到，特别是在鉴定表型相似的微生物物种时，经常会获得假阳性结果[6，7]。同时，这类方法还无法识别不可培养的细胞。随着生物化学知识的不断发展以及功能强大的仪器出现，传统生化方法的使用开始减少，并且开发出了更多的现代生物化学方法，与传统的基于培养的方法相比，具有许多优势，如分析时间缩短并能够测定多种微生物，同时还能很好地保证结果的准确性[7-9]。

1.1 基于质谱的方法

质谱法(Mass Spectrometry，MS)是通过分析电离分子质荷比(m/z)，从而对样品分子组成进行定性定量分析的一种方法，实验过程中根据离子产生的质量图谱对样品分子组成进行确定。1975年，Anhalt等首次将质谱技术应用于细菌鉴定领域[11]，1996年Claydon等成功鉴定了革兰氏阴性菌和阳性菌[12]。随着质谱技术的不断发展，以及新的数据分析、处理和可视化工具的发展，质谱技术在微生物检测和鉴定中的应用越来越广泛[10，12-16]。

1.1.1 液相色谱-质谱(LC-MS) 液相色谱(Liquid Chromatography，LC)与质谱的结合，彻底改变了代谢物组的分析测定方法，从而实现了通过分析一些不挥发或热不稳定的高分子化合物进行微生物的鉴定[17，18]。LC-MS主要用于临床应用中的微生物鉴定[19]，它也可用于检测饲料中枯草芽孢杆菌和大肠杆菌，并确定酿酒酵母的完整代谢物组覆盖率[20]。在LC-MS中，使用进样器将样品注入溶剂流，并在固定相化学键合的色谱柱内进行分离，柱中的洗脱液穿过光谱仪中的流通池，以无损识别具有光谱结构的化合物(发色团或荧光团)。

随着质谱分析仪和电离技术在LC-MS技术方面取得了进步，新的平台也逐步发展起来，包括快速LC-MS、LC-MALDI-MS、LC-ESI-MS-MS、LC-NMR-MS、亲水相互作用液相色谱(HILIC)-MS，反相LC-MS和离子迁移谱，变性高效液相色谱法(DHPLC)等[21-26]。其中DHPLC是一种新的有发展前途的方法，特别是在微生物鉴定和监测方面[27，28]。

1.1.2 气相色谱-质谱(GC-MS) 气相色谱与质谱的联用已广泛应用于鉴定复杂的生物混合物[29-31]。GC系统包括一个气源、一个进样器和一个位于柱箱内的柱，具有良好的分离效率，可与质谱仪相连。MS可以提供区分化学中不同代谢物的质谱图，两者的联合使用可以使检测结果更准确。此外，GC-MS还具有高灵敏性、易用性、低成本、丰富的线性范围以及商业和公共数据库的可访问性[32-34]。该方法通常用于非极性分子分析(例如，脂质成分)[35]，并通过评估其脂质元素对微生物进行分类。

GC-MS的主要缺点在于——该过程要求分析物为挥发性形式，由于某些代谢物是非挥发性的，因此需要耗时的衍生步骤[36-38]。为了优化该技术的性能，可以将某些技术与GC-MS结合使用，例如GC-GC飞行时间(TOF)-MS[39，40]。在这种情况下，将两个不同的GC柱结合在一起，从而增加了代谢物的检测范围，并提高了扫描速度(TOF-MS)的灵敏度，从而提高了检测效率。然而，这种方法成本较高，因此尚未被常规使用。火焰电离检测器(FID)-GC-FID的连接还可以用于常规样品分析，该方法快速，非常灵敏，并且成本较低[41]。

1.1.3 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS) MALDI-TOF MS是用于微生物快速鉴定和分类的最新一代工具。该方法的原理是基于短脉冲激光对微生物细胞的电离，然后利用电场在真空系统中加速颗粒[16，42]。电离后，获得光谱图形式的分子指纹，该指纹对于每种微生物都是特异的，将该频谱与现有数据库进行比较，通过自动化程序对其进行识别。MALDI-TOF的主要优点是节约时间，鉴定过程不再需要24 h～48 h，只需不到1 h即可完成。

MALDI-TOF MS是目前在储粮和环境中致病微生物检测和鉴定中最常用的技术之一[43，44]，具有快速、准确、灵敏的特点，可分为全细胞分析和细胞裂解物分析。在实际过程中，通过对粮食中微生物的特征性生物标志物进行检测，将含有标志物分子量和结构信息的质谱图，与基因组和蛋白质数据库中的质谱图进行比较，完成对储粮微生物的快速鉴定，并进行产毒机理的探究以指导粮食储藏微生物防治工作的开展[45-48]。

MALDI-TOF的替代方法是电喷雾电离(ESI)-MS，该方法可以分析液态样品并在大气压下进行的电离，而无需重复使用与MALDI-TOF-MS中相同的激光。因此，ESI-MS在微生物鉴定方面具有更广泛的应用范围[21，49-51]。

1.2 光谱法

光谱法是一种强大的多元且可重现的方法，在现今的研究中显示出巨大的潜力。光纤光谱学处理分子官能团的振动和旋转，这是辐射与样品相互作用时能量转移的结果，并引起电子激发、振动变化和旋转变化。光谱随样品分子组成的不同而变化，因此，它们与样品的化学成分(蛋白质、脂质、碳水化合物、膜、药物、人体组织等)有关。从理论上讲，任何样品都可以通过光谱学进行虚拟分析，并与分子生物学互补。因为它们通常不需要破坏微生物，因此这些方法具有更高的使用价值。同时该方法也存在一些局限性，建议在使用每种方法前可以使用多种光谱分析技术对其进行仔细的验证。

1.2.1 红外光谱(FTIR) 傅里叶变换红外光谱(FTIR)具有通用性、快速性、非侵入性的特点，并且与其他方法相比[52-55]更易于执行，在微生物学的多个领域都有应用。这种分析技术是一种无化学和无标签的方法，可以清晰地阐明整个样品的化学成分和物理状态，可以分析多种生物分子。仅使用极少量的样品，就可以通过一次测量获得有关主要生物分子(如脂质，蛋白质，碳水化合物和核酸)的详细信息[56]。

使用这种技术评估微生物的整个生物系统会导致光谱非常复杂，出现主要化合物的吸收谱带重叠的现象。因此，为了从光谱中只提取正在研究的生理过程的相关信息，适当的多元统计分析至关重要[57]。

1.2.2 拉曼光谱-振动光谱 另一种广泛使用的光谱方法是拉曼光谱法，它可对微生物进行非侵入性，快速表征和鉴定，因而得到了广泛认可。它以低成本、快速和多样的报告结果(微生物中的化学组成，结构以及生物分子的相互作用)与其他系统区分开[58，59]。与其他光谱表征一样，当光入射到物质上时，拉曼光谱结果取决于其与原子和分子的相互作用。当原子振动时，它将改变具有非极性基团(例如C-C和S-S强拉曼带)的官能团的极化率。近年来，拉曼光谱已广泛应用于微生物鉴定[60-64]。

红外光谱和拉曼光谱都是振动光谱的形式，可以提供“整个生物指纹”，如Lu，X.等所述[63]，振动光谱法是根据生化成分来区分微生物，因此对于区分同一物种之间的微小差异非常有用。此外，Lu等[65]还将拉曼光谱技术与微流体芯片结合对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行了快速鉴定。Zhang等[66]也利用便携式拉曼光谱仪通过金纳米颗粒与样品混合对致病性肠菌进行了快速鉴定，实验结果表明拉曼光谱技术可以在2 h内不需要培养基的情况下对致病性微生物进行快速、准确的鉴定，因此可在粮食收购环节及储藏期内对微生物污染情况进行快速准确的判定，并即时采取相应的措施，减少粮食损耗。

1.2.3 核磁共振波谱学(NMR) NMR光谱学是一种用于鉴定微生物的替代性有效技术。向原子核施加强磁场和射频脉冲，磁场会引起核自旋，吸收射频能量(从低能到高能自旋态)，并检测到辐射的发射[67]。与其他方法相比，NMR可以以无创的方式进行。此外，它的灵敏度降低，检测限较低(1 μM～5 μM，并且需要相对较大的样品量约500 μL)，尽管这些问题因它是一种定量方法而得到平衡[68]。

1.3 电动分离方法

电动学一词在科学上是指带电粒子通过基质时的相对运动。这种方法利用微生物组成的差异来获得不同的迁移模式，这样，在不重复样品标记的情况下，就可以分离得到不同的微生物。

毛细管电泳(CE)-MS由Joseph Loo于1989年开发并首次发表。它结合了电泳分离过程和质谱检测[69]。与GC和LC方法相比，它具有更好的分离效率，样品用量更少，速度更快，试剂成本更低以及单次运行即可分离得到阳离子、阴离子和不带电荷分子的可能性。CE由于使用样品体积小导致检测灵敏度不足，尤其是当与MS连接时，可访问的商业库数量有限，并且保留时间的再现性降低。Armstrong等[70]将CE与毛细管等电聚焦(CIEF)结合使用，可以分离和识别具有各种尺寸和形状的7种微生物。这项研究的独特之处在于，它证明了可以通过利用通常局限于大分子的技术来有效分离完整的生物细胞。目前另一种可能的方法是将CE与荧光相结合，用于观察分离过程，并通过这种方法从细胞聚集和聚焦效应方面监测操作条件和微生物动力学[71-73]。

电场流分级分离(EIFFF)是另一种利用微生物在电场中迁移能力的分离技术。2000年证实了其可用于微生物鉴定[74]。它基于在不同电场的影响下，由于各组组件的不同层(分级)而导致的通道中样本组件的分离。EIFFF装置利用通道的两个主壁在电极之间产生电势差，从而导致电荷之间的分离[75]。

1.4 微流控芯片技术

微流控技术是一门以微机械加工、生物技术和微纳米化学分析等为基础发展起来的交叉学科。自上世纪90年代初期由Andreas等人提出并实现以来，微流体研究领域已经取得了迅速发展[76]。近年来，关于微流体芯片在微生物检测中应用的报道有很多[77-80]。

微流控芯片技术在微生物检测中的应用具有很多优势，如样本消耗少、检测通量高、灵敏度高且可以进行在线实时监测，在食品安全控制、环境监测和临床诊断中具有巨大的适用性。目前利用微流体芯片进行微生物检测和鉴定的方法主要集中在将该技术与一些分析用的标准技术进行组合，无需标记程序。主要是与PCR技术[81，82]、质谱技术[81，83，84]、光谱法[85]和电化学[86，87]等技术的组合使用。

2 分子生物学技术用于微生物鉴定

分子生物学时代的到来为各种临床和研究目的细菌检测、鉴定、表征和分型带来了快速、准确的工具和技术[88]。基因型方法已能鉴定以前未知的种类繁多的分类群，鉴定无法培养的细菌，并促进了对各种细菌群落的宏基因组学研究[89]。随着分子生物学技术的快速发展，细菌鉴定的分子方法也从基于DNA扩增的方法(PCR、实时PCR、PARD-PCR)到基于限制性片段分析，靶向基因和全基因组测序以及质谱的更复杂的方法。

2.1 16S rRNA测序

从相对较低的起始材料中快速扩增核酸靶标，使PCR(聚合酶链式反应)成为可用于检测细菌靶标的最灵敏技术之一。16S rRNA基因对每种细菌都具有高度特异性，因此成为微生物鉴定的理想靶标。标准方法包括对16S rRNA基因进行PCR扩增，然后测序并与已知数据库进行比较以进行鉴定。但在两个紧密相关的物种中16S rRNA基因相同的情况下，其他保守基因，如rpoB，tuf，gyrA，gyrB和热激蛋白常被用作靶标基因[90-92]。基于PCR的方法不仅比传统的基于培养的方法快，而且有助于鉴定在实验室条件下难以生长的细菌。目前，基于PCR的鉴定方法已成功并广泛用于微生物检测和鉴定[93-95]。

2.2 荧光定量PCR

与常规PCR相比，荧光定量PCR又称实时定量PCR(Real Time-PCR)具有许多优势，如更高的灵敏度和准确性，以及能够通过荧光强度实时监控DNA扩增的能力，从而无需进行任何PCR后检测。RT-PCR也可以是定量的或半定量的，使用Cq值(荧光强度超过可检测水平的循环数)来定量DNA的数量。与常规PCR一样，RT-PCR在实验室研究以及临床中也有广泛的应用。它也适用于多种样本，如从牛奶中原本无法培养的细菌的鉴定[96]到土壤生态系统中细菌的鉴定[97]。使用针对16S rRNA基因保守区域的通用引物，已开发出一种可检测鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、克雷伯氏肺炎菌和绿脓杆菌的测定方法[98]。

2.3 随机扩增多态性DNA技术(RAPD-PCR)

与以前描述的基于PCR的方法不同，多态性DNA(RAPD)-PCR的随机扩增采用短引物(8至12个核苷酸)，其任意序列与模板细菌DNA非特异性结合。这导致模板DNA随机重复区域的扩增，从而为细菌鉴定提供了独特的方法[99]。RAPD-PCR反应可以从分离的DNA或粗细菌裂解液开始，然后在存在RAPD引物(或一组引物)和低水平的镁离子(以增强非特异性退火)的条件下进行扩增[100]。然后将扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，以产生独特的RAPD指纹。由于RAPD-PCR的引物通常是随机结合模板的DNA片段，因此不需要提前知道目标基因组的序列。这意味着它可以用于识别和分类各种细菌种类，这些细菌种类尚未被识别，或者无法提前获得序列数据。此外，它可以直接从整个细菌中进行，而无需分离DNA，并且可以应用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的鉴定[100]。

2.4 限制性片段长度多态性

限制性片段长度多态性(RFLP)是一种使用独特指纹来鉴定细菌菌株的方法，该指纹依赖于同源DNA序列中变异的存在(多态性)。这种基于PCR的方法使用了限制性内切酶，该酶可以识别扩增的DNA(PCR产物)并将其切割成不同长度的DNA片段。如在RAPD中一样，这些不同的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，从而为每个细菌菌株生成独特的条带模式。如果两个菌株紧密相关，则它们的带状谱将相同或非常相似。另一方面，条带模式的差异表明细菌菌株的多样性。这项技术在调查传染病暴发的分子流行病学方面具有高度相关性，在此过程中，确定多个病例或患者是否属于同一暴发，追踪暴发源并确定单个或多个细菌菌株非常重要[101]。

2.5 扩增片段长度多态性

扩增的片段长度多态性(AFLP)与RFLP相似，因为它使用限制性内切酶(通常是一对)来将基因组DNA切割成线型的，然后使用连接的衔接子来扩增限制片段的子集。通过使用与衔接子序列互补但也具有某些独特核苷酸的引物实现该扩增。因此，仅少量的限制性片段被选择性地扩增。然后使用凝胶电泳分析AFLP指纹，从单个细菌基因组DNA产生一组不同的DNA片段。显然，在没有任何现有的基因组序列知识的情况下，AFLP具有很高的特异性和辨别性[102]。

2.6 脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳(PFGE)是一种分离DNA大片段的方法，对流行病学研究中细菌的鉴定和分型特别有用，是目前在核酸和分子水平上鉴定细菌的主要手段。在PFGE中，用释放染色体DNA的酶和去污剂(蛋白酶和SDS)处理琼脂糖塞中的纯细菌菌株。然后将琼脂糖塞子与限制性内切酶一起孵育，该酶在特定位点切割以产生有限数量的DNA片段，使塞子在磁场中经电流作用，交替旋转(这会增强大的DNA片段的运动)，导致DNA片段的大小分离并出现模式条带[103]，从而实现细菌的鉴定。

2.7 核糖体分型

核糖体分型是一种用于细菌鉴定和表征的方法，与其它分子分型方法不同，它采用基于rRNA的系统发育分析。鉴于rRNA基因(如16S rRNA)在细菌物种内高度保守，因此识别16S rRNA基因多态性反映了细菌物种的进化谱系，可以阐明细菌的分类以及毒理学、分类学、流行病学研究[104]。核糖体分型通常涉及一个多步骤过程，该过程以靶向目标基因组序列的限制性内切酶为起点，然后进行Southern印迹转移和与探针的杂交，并分析核糖型RFLP带。随着分子工具的进步和对基因组序列的了解，已对该技术进行了多种修改[104]。需要注意的是，出于引物和探针设计的目的，核糖体分型分析需要对所研究的基因组序列有一定了解[105，106]。

2.8 全基因组测序(WGS)

全基因组测序技术(WGS)最近已成为国际上食源性致病菌鉴定，分型和溯源的金标准技术。微生物全基因组测序涉及对细菌、病毒或其他微生物的整个基因组进行测序，并将序列与已知参考序列进行比较。对于检测低频突变、发现关键缺失与插入以及发现微生物菌株之间的其他基因变化来说，快速准确地生成微生物基因组序列信息十分重要。整个细菌基因组的分析不仅为细菌的类型和进化谱系提供了前所未有的见解，而且还彻底改变了我们了解抗菌素耐药性和爆发调查的方法。WGS技术和分析管道的进步迅速提高了输出和分析速度，同时也降低了总成本[107]。

3 总结

在过去的几十年中，出现了很多用于确定粮食微生物样品身份的工具。尽管有局限性，但培养和显微镜检查方法仍然是最常用的两种技术，快速，低成本，灵敏和可重现性的进行微生物筛选的方法的发展仍是现代科学发展中的重要问题。随着分子生物学以及质谱技术的不断发展，用现代方法(MALDI-TOF MS或电迁移技术等)替代费时费力的表型方法，是食品安全领域和医学诊断行业所面临的现有挑战的解决方案。此外，我们一方面仍需不断地研究和开发新的有效的储粮微生物检测技术，另一方面也要综合利用现有的检测方法，以形成多技术方法融合的快速、准确的检测技术，为有害微生物的综合防治提供可靠的、科学的决策依据，将储粮损失降到最低。