DACT2、PITX2在结肠癌、腺瘤组织中的表达及意义

牛昊书， 陈 吉， 侯羽菲

1.内蒙古包钢医院消化内科，内蒙古 包头 014010；2.青岛西海岸区人民医院消化内科

近年来，结肠癌在我国的发病率呈逐年上升趋势，Muto等[1]在1974年揭示结肠腺瘤是结肠黏膜癌变过程中的一个阶段，随后Fearon等[2]证实了“结肠腺瘤—结肠癌”的发展顺序，证明大部分发生恶变的结肠黏膜组织在早期阶段可能是腺瘤。位于染色体6q27上的β-环连蛋白抑制基因2(dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 2，DACT2)[3]作为肿瘤抑制基因得到了广泛的关注，其通过抑制Wnt/β-catenin信号通路介导在结肠癌的生长和转移过程中发挥重要功能[4]。配对样同源转录因子2(paired-like homedomain transcription factor 2，PITX2)位于染色体4q25-27上，首先在垂体中被发现，是涉及几种器官和组织及早期胚胎发育所需要的一种转录因子[5]。PITX2是位于Wnt/β-catenin信号通路的下游靶标基因之一，参与调控多种癌基因的表达，该通路的激活可能会引起机体中PITX2的表达上调，进而使癌基因表达增加，导致细胞增殖、分化和迁移呈现异常状态，最终发挥促进肿瘤发生和侵袭的作用[6-7]。本研究旨在探讨DACT2和PITX2在结肠黏膜癌变过程中的作用及临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取在2018年12月至2019年10月就诊于内蒙古包钢医院消化内科行结肠镜检查的患者，收集镜下表现联合病理诊断为正常结肠黏膜30名，结肠腺瘤30例，结肠癌30例。排除标准：家族性腺瘤性息肉病史；既往或现在患其他系统恶性肿瘤；内分泌系统疾病史；既往或现为炎症性肠病者。

1.2 实验分组根据最终病理结果进行分组：正常对照组30名，男13名，女17名，年龄(54.70±10.25)岁，结肠腺瘤组30例，男16例，女14例，年龄(55.90±11.18)岁，结肠腺癌组30例，男18例，女12例，年龄(59.36±9.09)岁。各组患者的性别及年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.3 实验方法

1.3.1 主要试剂与仪器：Trizol(美国Ambion)，HiScript Reverse Transcriptase(诺唯赞)，SYBR Green Master Mix(Invitrogen)，PCR引物(Invitrogen)，电子结肠镜(奥林巴斯)，实时荧光定量PCR仪(美国ABI)，全自动酶标仪(Thermo Fisher Scientific)，微量分光光度计(奥盛公司)。

1.3.2 标本的采集与存放：所有患者在进行结肠镜检查前完成术前谈话，签署知情同意书，在患者行结肠镜检查或治疗时，取得活检标本。将镜下取得的新鲜标本放入冻存管中，保存在超低温冰箱中(-80 ℃)。

1.3.3 qRT-PCR检测DACT2和PITX2基因mRNA的表达：将样本迅速移至匀浆管，加入1 ml的Trizol裂解液，将匀浆器调至6 500 r/min，震动15 s，裂解10 min，将200 μl氯仿加入混合液中，摇晃后置于室温中5 min，然后将其转入离心管中，4 ℃ 12 000 r/min,离心15 min(离心半径8.5 cm)，得到上层水相加入400 μl异丙醇，于室温中搁置10 min，再次4 ℃ 12 000 r/min,离心10 min(离心半径8.5 cm)，将上清液遗弃，加入75%乙醇1 ml，再次4 ℃ 10 000 r/min离心5 min(离心半径8.5 cm)，再次弃去上清液，将干燥的RNA溶于20 μl DEPC水中，从中分装出2 μl测定核酸浓度，剩余RNA溶液-80 ℃保存。去除总RNA中的基因组DNA冰上配制反应混合液。反转录需要按照一定条件进行，反应条件为:25 ℃，5 min，50 ℃，15 min，85 ℃，5 min，4 ℃，10 min。制备完成后暂时不用者可-20 ℃保存备用。经过上述处理后最终获得cDNA，qRT-PCR相对定量检测可以以其为模板进行，最终获得DACT2和PITX2基因mRNA表达状况。

2 结果

2.1 DACT2 mRNA在正常结肠黏膜组、结肠腺瘤组、结肠癌组中的表达DACT2 mRNA在三组中的表达呈逐渐降低趋势，在正常对照组中表达最高，在结肠癌组中表达量最低，且差异有统计学意义(P<0.001)，三组组间比较，结肠腺瘤组表达量低于正常结肠黏膜组，差异有统计学意义(P<0.001)，结肠癌组低于结肠腺瘤组，差异有统计学意义(P<0.001)，结肠癌组与正常结肠黏膜组对比,差异有统计学意义(P<0.001)(见表1)。

2.2 PITX2 mRNA在正常结肠黏膜组、结肠腺瘤组、结肠癌组中的表达PITX2 mRNA在结肠癌组中的表达量最高，正常对照组中表达量最低，呈逐渐上升趋势，且三组间比较差异有统计学意义(P<0.001)，结肠腺瘤组相对表达量低于结肠癌组，差异有统计学意义(P<0.001)，结肠腺瘤组表达量明显高于正常结肠黏膜组，差异有统计学意义(P<0.001)(见表1)。

表1 DACT22与PITX2 mRNA在三组中表达的比较

2.3 DACT2与PITX2 mRNA在正常结肠黏膜、结肠腺瘤、结肠癌中表达的相关性在正常结肠黏膜组，DACT2与PITX2 mRNA的表达呈负相关，差异有统计学意义(r=-0.483，P<0.05)；在结肠腺瘤组，DACT2与PITX2 mRNA的表达呈负相关，差异有统计学意义(r=-0.403，P<0.001)；在结肠癌组中DACT2与PITX2 mRNA的表达呈负相关，差异有统计学意义(r=-0.733，P<0.001)(见图1～3)。

图1 DACT2与PITX2 mRNA在正常结肠黏膜组中表达的相关性

图2 DACT2与PITX2 mRNA在结肠腺瘤组中表达的相关性

图3 DACT2与PITX2 mRNA在结肠癌组中表达的相关性

3 讨论

结肠癌作为消化系统常见的恶性肿瘤，已经越来越多的被人们所熟知。近年，结肠癌在我国发病率每年呈递增的趋势。随着内镜诊治技术的不断进步,大幅度提高了结直肠息肉的检出率,1/2～3/4的结直肠息肉为腺瘤性息肉[8]，其中约20%的腺瘤性息肉最终进展为腺癌，早期发现并及时行内镜下切除可大幅降低结肠癌的发生率[9]。尽管对结肠黏膜恶变的研究较多，但机制仍未完全清楚，通过对结肠腺瘤癌变的分子生物学机制研究，将可能揭开结肠腺瘤癌变机制的面纱并对结肠癌的早期诊断、预防及治疗提供帮助。

在Wnt/β-catenin路径中，各种原因引起β-catenin降解减少可使其在胞浆中不断积聚，继而致其细胞核内转运增加，致T细胞因子/淋巴细胞增强因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)共激活，进而致下游靶基因激活。目前已知β-catenin的主要伴侣是TCF/LEF家族，在Wnt靶基因的转录调节中发挥作用。Yu等[10]通过敲低胃癌细胞系中的DACT2，发现β-catenin和c-myc的表达增强，考虑为β-catenin磷酸化的水平降低致其降解减少，其向我们揭示了Wnt/β-catenin信号传导通路可能被DACT2所抑制，从而抑制肿瘤进展的机制。相关研究表明，TCF/LEF的家族成员淋巴细胞增强因子1(lymphoid enhancer factor-1，LEF1)以及β-catenin与DACT2有密切的关联性，DACT2既能与β-catenin形成紧密联结，又能与LEF1联结，从而减少β-catenin-LEF1复合物在细胞核中的形成，干扰肿瘤中Wnt信号路径的触发，这是结直肠腺癌中DACT2抑制Wnt/β-catenin信号通路作用的重要机制[4]。Jia等[11]研究表明，肺癌细胞的增殖和分化可以通过DACT2干扰Wnt信号通路而受到抑制。在肺癌细胞中启动子区域高甲基化与DACT2表达沉默密切相关，在经过5-氮杂-2′-脱氧氮杂胞苷诱导后可使DACT2重新表达，说明原发性肺癌中的启动子区域高甲基化可使DACT2表达沉默。相关研究[12-13]表明，乳腺癌中DACT2甲基化频率较高，Wnt路径可因DACT2启动子区域发生甲基化沉默后发生激活，β-catenin降解减少至其胞浆中浓度升高进而转运至细胞核增多，使TCF/LEF激活，进一步激活下游靶基因的表达从而促进乳腺癌发生以及转移，间接表明人乳腺癌细胞中的Wnt/β-catenin信号通路可被DACT2抑制而产生抑癌作用。Lu等[14]通过研究表明，DACT2与β-catenin直接联结可抑制细胞核中β-catenin/LEF1复合物形成，最终抑制肿瘤发生、进展。DACT2作为肿瘤抑制基因被研究证明是通过抑制Wnt/β-catenin信号传导途径从而达到抑制肿瘤生长，侵袭和转移目的。本研究结果表明，DACT2基因的mRNA在正常黏膜组、结肠腺瘤组、结肠腺癌组中的表达呈现逐渐下降的趋向，差异有统计学意义。据此可知，DACT2与结肠腺瘤癌变的过程呈负相关，DACT2 mRNA的含量在癌变过程中存在规律性的表达降低，当DACT2 mRNA表达降低时肿瘤恶变倾向也继之升高，推测DACT2在结直肠癌的发生发展中发挥抑制作用，但仍需进一步行基因敲除研究加以证实。今后或许可通过检测DACT2的表达量来作为结直肠癌早期诊断的方法之一，通过影响DACT2的表达作为预防结直肠腺瘤癌变的手段之一，并为结直肠癌基因治疗的靶点提供新的方向。

PITX2是Wnt/β-catenin信号通路的下游效应物之一，其作为转录因子在肿瘤进展中激活下游癌基因。相关研究[6，15-16]表明，细胞周期调节因子C-myc和Cyclin D1可以通过上调PITX2的表达而增加，从而促使肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭增强。Aubele等[17]发现,PITX2在乳腺癌中的表达增多，经典Wnt信号途径中β-catenin可增强下游PITX2的表达进而促进细胞周期调节因子的表达，进而推导PITX2可能通过Wnt/β-catenin途径促进癌细胞发生、发展。Huang[18]等在敲除了PITX2基因的体外培养的人甲状腺癌细胞中，发现细胞周期调节因子Cyclin D2的表达下调。提示甲状腺肿瘤的发生发展可能与β-catenin-PITX2通路、PITX2转录调节Cyclin D2表达增强有关。当激活Wnt信号通路后，Wnt与细胞表面的多种蛋白受体结合成复合物使β-catenin与其蛋白形成复合物的过程受到抑制致游离β-catenin增多。另外的β-catenin难以被磷酸化和泛素化降解，其进入细胞核后与转录因子TCF/LEF联结可以增强下游靶基因PITX2的表达。本研究结果提示，在正常结肠组、结肠瘤组、结肠癌组中PITX2 mRNA的表达水平呈逐步上升的趋势。PITX2的表达水平与结肠腺瘤到结肠癌的过程呈正相关关系，PITX2基因的过度表达可能会促进结肠腺瘤癌变过程的发展。围绕PITX2基因表达与结肠癌发生机制的研究可能会对结肠癌的早期诊断及治疗提供新的思路和方法，这尚需进一步动物实验加以证实。

Wnt/β-catenin信号通路的经典功能是通过增加细胞质β-catenin的水平，增强β-catenin的核转运，充当T细胞因子(T cell factor，TCF)的转录共激活因子，以增强下游靶基因的激活调控。Wnt通过触发复杂的具有差异性的细胞表面胞内段的活化信号级联反应将细胞外信号传导至细胞内，以调节细胞分化、生长及发育等。同时在肿瘤的发生中，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活也起到了重要的作用[19]。本研究中，DACT2和PITX2基因mRNA的表达含量在正常结肠黏膜、结肠腺瘤及结肠癌组织中有显著性差异，二者在结肠腺瘤癌变的过程中表达呈显著负相关。上述结果表明，DACT2与PITX2可能分别在结肠正常上皮-腺瘤-结肠癌的演变过程中发挥着不同的作用，结合既往研究，其机制可能为DACT2基因通过Wnt/β-catenin路径调控下游PITX2基因的表达，PITX2为在结直肠腺瘤癌变中起促进作用，DACT2作为上级调控位点通过抑制Wnt/β-catenin路径间接抑制PITX2的表达，从而对结直肠腺瘤癌变过程起抑制作用，多种因素可能通过影响到DACT2的表达活性从而调节Wnt/β-catenin信号通路，但影响DACT2基因表达的具体机制尚不清楚。通过本研究结果，我们推测在结肠腺瘤癌变的过程中PITX2与DACT2分别发挥重要作用并可能相互影响，但其具体证据链尚不完整，二者在结直肠腺瘤癌变过程中的分子机制以及详细的上下游作用机制尚不清晰，需进一步行深入的动物实验研究加以论证。