外泌体circRNA 在肝癌中的作用及其分子机制研究

赵彦龙，谢泽伟，赵守和，马森

（深圳市坪山区人民医院 普外科，广东 深圳 518118）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，位居死因第二位，其发病率与死亡率一直居高不下［1］。我国目前主要采用B 超检查和血清甲胎蛋白（AFP）进行肝癌筛查和诊断，然而有报道［2］显示该方法的敏感度存在差异且具有局限性，很多早期肝癌未能及时发现。circRNA 是一种非编码RNA，具有闭环结构，目前已有研究［3］表明多种circRNA 可作为肝癌诊断的标志物。外泌体是一种可来源于多种细胞的膜性囊泡，通过传递细胞间物质信息，调节肿瘤的微环境，进而在肿瘤的发生发展中发挥重要作用［4］。本研究探讨外泌体circRNA 在肝癌中的作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 组织样本本研究收集2019 年1 月至2020 年8 月在我市某院经病理检查确诊的20 例原发性肝癌患者的手术切除的废弃标本，包括肝癌患者肿瘤组织以及肿瘤边缘5 cm 处的癌旁组织。排除具有严重心血管疾病、肝肾功能不全、肿瘤、免疫系统疾病的患者的组织，纳入患者均已知晓手术标本用途并签订知情同意书。

1.2 外泌体提取与鉴定将所得肿瘤组织及癌旁组织存放于无血清培养基进行培养。收集细胞培养上清液，以2 000 ×g 离心30 min 并去除杂质，在4 ℃条件下孵育0.5 h，继续以10 000 ×g 离心10 min，沉淀用PBS 重悬，即可获得外泌体悬液，并在电镜下观察外泌体形态。

1.3 QGY－7703 和SMMC－7721 细胞培养转染QGY－7703 和SMMC－7721 肝癌细胞采用DMEM 培养基进行培养，当细胞生长密度达90%时，根据试剂说明书将circ－CDYL 或siRNA 转染至细胞内。

1.4 细胞增殖实验实验分为对照组、circ－CDYL 低表达及高表达组，采用CCK－8 试剂盒检测细胞增殖。QGY－7703 和SMMC－7721 细胞培养48 h 后加入CCK－8 试剂，随后培养2 h采用酶标仪测定吸光度。

1.5 细胞侵袭能力将Transwell 小室用Matrigel 基质胶进行包被，用以检测细胞侵袭能力。实验分为对照组、circ－CDYL 低表达及高表达组。将无血清细胞悬液加至Transwell 室上部，将含10%血清的培养基加入下部，培养24 h 后用甲醇固定30 min，并用结晶紫染色镜下观察。

1.6 统计分析采用SPSS 22.0 统计软件处理数据，计量资料用均数± 标准差表示，组间比较采用t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织中差异表达最显著的circRNA 为circ－CDYL本研究采用环状RNA 芯片，对比分析20 例肝癌患者的肿瘤组织及癌旁组织中circRNA 的表达谱，结果显示，癌旁组织与肿瘤组织中差异表达的circRNA 有161 种，其中circ－CDYL 差异表达最为显著。

2.2 转染后QGY－7703 和SMMC－7721 细胞外泌体中circ－CDYL 的表达水平在QGY－7703 转染后，稳定过表达circ－CDYL 的细胞外泌体中的circ－CDYL 含量较稳定干扰的更多；同样的结果在SMMC－7721 细胞中也可观察到，稳定过表达circ－CDYL 的细胞外泌体中circ－CDYL 的含量均显著较高，稳定干扰的表达则较低。见表1。

表1 转染过表达及干扰载体的QGY－7703 和SMMC－7721 细胞外泌体中circ－CDYL 的表达水平（）

表1 转染过表达及干扰载体的QGY－7703 和SMMC－7721 细胞外泌体中circ－CDYL 的表达水平（）

2.3 circ－CDYL 对肝癌细胞增殖及侵袭能力的影响在QGY－7703 和SMMC－7721 细胞转染后，与circ－CDYL 高表达的细胞外泌体相比，circ－CDYL 低表达的细胞外泌体与肝癌细胞共培养后，细胞增殖和侵袭受到抑制。见表2。

表2 QGY－7703 和SMMC－7721 细胞转染后侵袭数量与CCK－8 结果（）

表2 QGY－7703 和SMMC－7721 细胞转染后侵袭数量与CCK－8 结果（）

3 讨论

外泌体（exosomes）是一种膜性囊泡，直径为40～100 nm，它可由B 细胞、T 细胞、树突细胞、血小板以及肥大细胞等不同细胞分泌。研究［5］表明，外泌体可传递细胞间的物质信息，调控肿瘤内部的微环境，这在肿瘤的发生发展中具有重要作用。近年来，越来越多的研究开始关注到环状RNA（circRNA），有研究［6］发现circRNA 在细胞的各项生命活动中均发挥重要作用，且circRNA 表达谱在肿瘤患者的肿瘤细胞与癌旁组织来源细胞间具有显著差异，这可能与肿瘤的发生发展密切相关。目前已发现的与肿瘤相关的circRNA 较多，circPVT1在胃癌组织中的表达量高于癌旁组织，可促进癌细胞增殖；circ0000096 在抑制胃癌细胞的增殖和转移中也发挥着重要的作用［7］。CiRS－7 在肝癌组织中含量较高，可增强肝癌细胞的增殖和侵袭能力。另有研究［8］表明，circRNA＿0007874 和circRNA＿104135 在肝癌组织中显著下调，可抑制肝癌进展。目前已有研究［9］表明，外泌体在肝癌的发生发展中承担着不可或缺的重要角色。外泌体的深入研究对于肝癌的筛查、诊断、分期、预后判断及治疗均有重要意义。

本研究探讨外泌体circRNA 在肝癌发生发展中的作用。首先通过基因芯片鉴定肿瘤组织与癌旁组织中circRNA 的表达差异，结果显示circ－CDYL 是差异最为显著的circRNA。CDYL基因位于Y 染色体上，该基因编码表达的蛋白质主要功能是调控神经系统生长发育及抑制基因转录等［10］。据此，本研究以circ－CDYL 为靶点，进一步探讨其在肝癌中的作用，构建circ－CDYL 过表达载体及干扰载体，在QGY－7703 和SMMC－7721两种肝癌细胞中转染，随后提取外泌体并检测其中circ－CDYL的表达水平，结果显示稳定过表达circ－CDYL 的细胞外泌体中circ－CDYL 的含量显著较高。采用Transwell 小室检测细胞侵袭力，circ－CDYL 高表达组的细胞侵袭力更高。CCK－8 实验结果也表明circ－CDYL 能够增强肝癌细胞的增殖活性。

综上，外泌体circ－CDYL 可增强肝癌细胞增殖及侵袭的活性，从而促进肝癌细胞的转移及发展，关于其具体的作用机制需要开展进一步的研究。