基于流式细胞仪和高通量测序技术联用的超微藻检测方法

宁 曼，徐 峥，何义亮

(上海交通大学中英国际低碳学院，上海 200240)

超微藻是水体中藻种群结构的重要组成部分，由于其独特的生长特性和丰富的物种组成，近年来受到国内外学者的广泛关注，成为水体中微生物构成的研究热点。超微藻在数量上虽不如传统的非超微藻[1]，但其对水体初级生产力和群落结构多样性及稳定性等方面贡献巨大，深入了解超微藻的动态变化规律有利于更好的评估水体水质质量。

目前的研究中，对超微藻进行检测的手段很少，且具有局限性。光学显微镜受到放大倍数和分辨率的限制[2]，无法满足细胞计数和种群识别的要求，具有耗时长、人为误差明显的缺点。而荧光显微镜对自发荧光较弱且混合生长的藻群辨认准确率低，不能反映藻细胞的生理状况。平板计数法耗时长，操作过程中对无菌环境条件要求极严格，且因超微藻大部分种属不能直接进行分离纯培养而无法运用[3]。

针对以上难点，流式细胞仪和高通量测序技术的运用为超微藻总量测定和种群识别提供了新方向。流式细胞仪能对超微藻进行计数和荧光检测，得到藻细胞数量，根据色素含量及与纯培养藻细胞位置的对照完成藻群识别，但一般只能精确到门级别，需要分子生物学手段的辅助从而获得更加准确的种属信息。高通量测序技术作为分子生物学技术的一个重要分支[4]，明确不同微生物的注释信息和相对丰度变化信息，有助于对微生物多样性及其分布模式进行更深入的探究，但针对超微蓝藻和超微真核藻的高通量测序方法还有待进一步研究和优化。在测序微生物的收集方法上，传统的水样过滤方法在很大程度上造成了对环境中超微藻多样性的低估[5-6]，流式细胞仪的分选功能可有效去除水体中大部分不能自发荧光的细菌、真菌等[7]，减少异样模版的竞争，提高超微藻序列在整个克隆库中的比例，解决了对超微藻细胞进行有效收集和保存的难题。近年来，已有研究尝试使用流式细胞仪分选功能进行真核藻类的分选[1]，但研究范围较局限。

本研究针对超微藻检测进行方法体系的构建和优化调整，在前人的基础上将流式细胞技术和高通量测序技术进行联用，改进技术流程和参数，流式细胞仪对超微藻的分选功能可以弥补高通量测序技术异养细菌干扰的缺点，而高通量测序技术鉴定精确到种级别的优点可以弥补流式细胞仪对超微藻识别不精确的问题。通过细胞大小和荧光分析对藻群变化初步认识，再利用流式细胞仪分选目标藻群，随后进行高通量测序，更好地揭示超微藻的结构特征和生物多样性。本研究提出综合运用流式细胞技术和高通量测序技术进行方法的互补融合和多功能联动，是非常重要而基础的方法改进。

1 方法的构建

1.1 整体流程的提出

综合运用流式细胞技术和高通量测序技术对超微藻进行检测，方法构建流程如图1所示。通过流式细胞仪的分析、分选功能和高通量测序技术的联用，获得超微藻的数量和种属信息，对特定采样周期的样本进行分析，获得超微藻构成的动态变化特征。

图1 方法构建流程Fig.1 Flow Chart for Method Construction

1.2 流式细胞仪参数设置及调整

1.2.1 溶液配制

鞘液的配制：准确称量NaCl(80 g)、KCl(2 g)、Na2HPO4·12H2O(35.8 g)、KH2PO4(2.4 g)，加入盛有1 L ddH2O的烧杯中，搅拌均匀，待完全溶解后通过0.22 μm微孔滤膜过滤，添加ddH2O至10 L，溶液置于桶中用高压灭菌锅进行121 ℃灭菌15 min，待鞘液冷却至常温后倒入分选仪器加液桶备用。

荧光微球(FluoSpheresTMcarboxylate，2 μm，yellow-green 505/515)原始浓度为4.65×109particles/mL，严格避光贮存于2～4 ℃冰箱中，吸取前使用超声波清洗机超声10 min，防止带磁性的微球吸附在管壁上，斡旋机高速振荡3 min，使微球混合均匀。配制中间液时，加入蒸馏水进行梯度稀释，使荧光微球在水样中的最终浓度与藻细胞浓度相近，本试验荧光微球最终浓度为4.65×104particles/mL。中间液需现配现用，置于5 mL锁扣盖式无菌BD Falcon流式管中。

1.2.2 参数设置及调整方法

采用流式细胞仪(beckman coulter，BD)对样本中的藻细胞进行分析，仪器配备水冷氩离子激光器，选用的激发波长为488 nm和633 nm。由于藻细胞含有叶绿素和藻胆素等天然色素，可自发荧光无需染色，根据光合色素的光学特征，设置5个荧光通道：前向散射光(FSC，488/10)表征细胞大小；侧向散射光(SSC，488/10)表征细胞内部结构的复杂程度；PE，585/42表征藻红蛋白的含量；APC，780/60表征藻蓝蛋白的含量；PC5.5，690/50表征叶绿素a的含量[9]。水样通过40 μm的滤网过滤，防止阻塞仪器。进行预试验验证荧光通道的有效性并对仪器参数进行调整，主要分为以下3个步骤：作为空白对照，1 mL无菌ddH2O置于5 mL无菌流式管中进行上样，调整各通道阈值，使无荧光黑团消失，去除水中杂质、破碎细胞及无关细菌的干扰；1 mL适当浓度的荧光微球置于5 mL无菌流式管中进行上样，调节各通道电压值，使荧光微球聚集且成像清晰，若出现荧光微球分散的情况，重新配制中间液，并保证溶液混合均匀，与步骤一空白对照组进行比较，去除杂质，调节前如图2(a)所示，调节后如图2(b)所示；1 mL过滤后的实际水体样本置于5 mL无菌流式管中，微调电压值使细胞全部成像于二维散点图中，调节进样速度，使每秒细胞数在100～1 000个。正式上机时，1 mL过滤后的实际水体样本与荧光微球混合上样，流速设置为中等流速30 mL/min，待进样稳定后点击record，每个样品运行3 min，每组试验设置3个平行。

图2 荧光微球调节示意图 (a)调整前；(b)调整后Fig.2 Adjustment of Fluorescent Beads (a) before Adjustment； (b) after Adjustment

1.3 超微藻的浓度测定及分选方法

在二维散点图中将荧光通道两两组合，含有相似色素或荧光特征的藻细胞聚集在一起，根据藻细胞藻蓝蛋白、藻红蛋白、叶绿素a荧光强度的相对强弱进行藻群的区分，并与纯培养细胞的相对位置进行比对。记录事件数events，藻细胞的浓度计算方法如式(1)。

(1)

在运用流式细胞仪进行超微藻的分选时，水样预先通过40 μm的滤网过滤，防止阻塞仪器。过滤后每3 mL样品放于5 mL锁扣盖式无菌BD Falcon流式管中用于上机分选操作，采用流式细胞仪(FACSAria IIr，BD)对样品中的全部超微藻细胞(包括超微真核藻和超微原核藻)进行分选，溶液配制同1.2.1所述，激光波长、荧光通道同1.2.2所述。观察分选通道中细胞通过状态及偏移程度，检验进样口和收集口是否处于无菌环境，预试验以无菌ddH2O为空白对照去除细菌等杂质的干扰，根据荧光微球在FSC轴的位置划定分选区域，选用1.5倍镜，调节荧光通道阈值和电压值使分选区域位于散点图中央，如图3所示。正式分选试验时，保证进样口和取样口处于无菌环境，开启样本搅拌功能，设置分选模式为Purity-Mode1，分选速度设定为2.0～4.0，每秒细胞数在1 000个左右。收集分选细胞的流式管中加入1 mL无菌PBS缓冲液和细胞溶解液，每个样品分选约35 000个细胞，在基因组DNA提取及23S rDNA高通量测序操作前置于-80 ℃冰柜。

图3 超微藻分选区域Fig.3 Sorting Area of Picophytoplankton Cells

1.4 高通量测序方法

目前，应用于超微藻多样性研究的靶基因序列主要包括16S rDNA、18S rDNA、功能基因rbcL等[5]，沉降系数和引物选取的不同，呈现出特定的测序结果和方向，高通量测序方法及参数的选取对测序结果具有重要影响作用。用于藻类检测传统的方法是16S rDNA测序，对蓝藻检测效果良好，但无法对真核藻类的种属信息和相对丰度进行全面认识。为了获得超微蓝藻和超微真核藻的序列信息，本研究采用23S rDNA高通量测序方法，方法如下所述，并与传统16S rDNA高通量测序方法进行补充和对比，方法参照文献[10]。

购买E.Z.N.A Water DNA提取试剂盒(OMEGA，美国)进行基因组DNA的提取，用于目的片段PCR扩增。随机选取样品进行PCR预试验，调整参数并评估扩增效果，最终确定正式试验程序，所采用的PCR仪为ABI GeneAmp© 9700型，选用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase 20 μL反应体系，包括4 μL 5×FastPfu Buffer、2 μL 2.5 mM dNTPs、0.8 μL Forward Primer(5 μM)、0.8 μL Reverse Primer(5 μM)、0.4 μL FastPfu Polymerase、0.2 μL BSA、10 ng Template DNA。扩增引物选定双前向引物(A23SrVF1：GGACARAAAGACCCTATG, A23SrVF2：CARAAAGACCCTATGMAGCT)和双逆向引物(A23SrVR1：AGATCAGCCTGTTATCC, A23SrVR2：TCAGCCTGTTATCCCTAG)[11]。PCR扩增反应程序参数：a.1× (3 min, 95 ℃)；b.循环数×(95 ℃，30 s；退火温度：55℃，30 s；72 ℃，45 s)；c.72 ℃，10 min，保持10 ℃直到反应结束。一轮扩增引物A23SrV1F_A23SrV1R，退火温度为55 ℃，循环次数为25；二轮扩增引物A23SrV2F_A23SrV2R，退火温度为55 ℃，循环次数为30。在进行扩增产物的纯化与回收时，设置3组平行试验，对电泳后的目标条带进行切胶回收和定量检测。本试验所有样本PCR质检报告等级达到B等级以上，Illumina MiSeq平台双端测序的原始数据和结果上传至NCBI网站。

1.5 数据分析与统计

流式细胞仪分析的原始数据以FCS格式储存，藻细胞的计数和荧光分析通过CytoFLEX软件完成，根据色素荧光、细胞大小和复杂程度，对照典型藻种纯培养试验结果相对位置，进行水体中藻群的分组，图片以BMP格式输出。藻细胞浓度的计算以及藻群的统计通过Microsoft Excel 2019完成，图表绘制使用Origin软件。

高通量测序的原始下机数据以FASTQ格式保存，对序列长度、模糊碱基、错误碱基、低质量碱基进行质量过滤，使用Mothur软件进行二次质量筛选去除嵌合体，获得最终的优质序列。运用Uparse7.0软件对97%相似水平下的OTU进行聚类分析，采用RDP classifier贝叶斯算法进行每个OTU对应的物种分类学分析，与Silva(Release132 http://www.arb-silva.de)基因数据库进行比对，分别在各个分类水平域、界、门、纲、目、科、属、种统计各样本的群落物种组成。OTU丰度数据进行标准化以确保不同样品间的一致性，去除丰度小于3的OUT，去除注释到叶绿体、线粒体的OTU，基于最小样本序列数进行抽平。本研究采用空白对照法和质量直方图法进行质控分析，所有样本的检测程序和效果均达到标准。

2 方法的实证

2.1 实际水体的选择与水样的处理

金泽水库是上海重要的饮用水水源地之一，来自太湖的原水流入太浦河后再进入水库，完成一系列的菌藻筛选和水质净化过程，属于较典型的“湖泊-河流-水库”复合型水环境系统，主要分为预处理区、生态净化区和输水区，营养级别较低，藻群结构稳定，呈现出较高的超微藻多样性。本研究所用样本取自上海金泽水库，在不同采样点和不同月份采集0.5 m水深处的表层水体各1 L，储存于不透光且洁净的塑料桶中，立即运回实验室并保存于4 ℃冷库中，本试验选取一部分具有代表性的样本进行分析。

水样采集以后，一部分用于直接分析和分选，另一部分储存用于后续或二次操作。每10 mL水样装入15 mL灭菌离心管中，添加戊二醛(最终浓度为0.1%)作为细胞固定剂[8]，液氮速冻，并保存在-20 ℃冰柜中，最大限度减少水样中的细胞损失。使用前放置于37 ℃水浴锅中解冻，并混合均匀。上样前所有水样需通过40 μm的滤网进行过滤，重复操作3次，防止对仪器进样口造成阻塞。

2.2 超微藻细胞分析及浓度测定

利用试验采得的新鲜水样进行流式细胞仪分析，完成藻细胞的识别、群体划分和浓度测量。根据在FSC轴藻类细胞与已知大小为2 μm荧光微球的相对位置，可将藻细胞划分为超微藻(小于2 μm)和非超微藻(大于2 μm)，如图4(a)所示。根据藻类荧光特性，将APC、PC5.5、PE、FSC、SSC坐标轴两两组合，水样中藻细胞呈现出明显的分组特征，藻群之间位置越接近说明荧光组成和细胞特征越相似，如图4(b)所示。藻群1藻蓝蛋白含量很高，且与聚球藻纯培养液在相同条件参数下的位置相近，被划分为超微蓝藻；与藻群1相比，藻群2含有更高的藻红蛋白和相对较低的藻蓝蛋白，被划分为富含藻红蛋白的超微蓝藻；其他藻群属于真核藻类，含有较高的叶绿素和较低的藻蓝蛋白，根据叶绿素含量的不同以及与典型蓝藻(Synechococcus)、绿藻(Chlorellavulgaris)、硅藻(Stephanodiscushantzschii)的纯培养液的相对位置，藻群3和藻群4区分为超微绿藻和超微硅藻。夏季超微藻生物多样性高于春季，8月水体样本中超微藻的数量在103～105cell/mL，其中输水口数量较多，超微蓝藻为2.46×105cell/mL，富含藻红蛋白的超微蓝藻为2.78×103cell/mL，超微绿藻为9.61×103cell/mL，超微硅藻为2.56×104cell/mL。

图4 藻群划分 (a)超微藻和非超微藻划分；(b)特征超微藻群划分Fig.4 Division of Phytoplankton Groups (a) Division of Picophytoplankton and Nanophytoplankton； (b) Division of Picophytoplankton Groups

2.3 超微藻分选及高通量测序

本试验每个样本分选约35 000个超微藻细胞，经预试验及PCR检测报告验证，基因组DNA提取效果良好，高通量测序数据量足够。得到平均长度为367的1 102 873个有效序列，与Silva数据库进行比对，共获得相似水平在97%以上的236 OTUs，超微藻的注释和分类按照Tranvik等[12]的描述。6个门类的超微藻被检出，包括蓝藻门(Synechococcus，Prochlorococcus)、绿藻门(Nephro-selmis，Tetraselmis，Choricystis，Nannochloris)、不定鞭藻门(Pseudo-nitzschia，Ochromonas，Thalassiosira、Chaetoceros)、异隐藻门(Cryptomonas，Teleaulax)、定鞭藻门(Emiliania，Chrysochromulina)和囊泡藻门(Dinophysis)。根据根据色素分析和丰度变化情况，判定流式细胞仪分析检测到的藻群2(富含藻红蛋白的超微蓝藻)是聚球藻(Synechococcu)的其中一种，藻群4(超微硅藻)的主要组分是海链藻(Thalassiosira)。与传统的过滤水样16S rDNA测序方法进行比较，除了普遍受到关注的超微蓝藻聚球藻以外，流式细胞仪分选和23S rDNA高通量测序的方法发现了更为丰富的超微蓝藻和超微真核藻，更好地揭示了水体中超微藻的生物多样性。与传统方法的藻类占比(<10%)相比，此方法藻类OTU占比达到76.3%，异养模版的干扰大大降低，由于分选操作对目标藻群的聚焦，相对丰度很低(<0.01%)的藻属也能被检测到。不能自发荧光但依然通过流式细胞仪分选与超微藻共同检出的部分细菌，如疣微菌、厚壁菌和变形菌，可能紧密附着在超微藻细胞的表面未被去除，推测这些细菌与超微藻之间存在着共生关系[13]。

2.4 存在问题分析

尽管流式细胞仪结合高通量测序的这种方法在超微藻监测的应用中具有极大优点，但仍然存在一些缺点，在今后的研究中应注意以下两个方面。第一，仪器因携带不便无法用于现场原位试验[14]，且对样本浓度的要求较高，因此，通常需要对新鲜水样进行固定，如何选用合适的固定剂成为主要问题。较常用的是戊二醛和多聚甲醛，也可适量添加表面活性剂，尽管使用了固定剂，仍可能造成细胞损失，尤其是结构较脆弱的超微蓝藻，后续研究应更多关注固定剂种类和浓度的选择。第二，多细胞的丝状蓝藻，如伪鱼腥藻、浮丝藻等，无法用流式细胞仪进行计数和分选[15]，应采用其他辅助方法来弥补流式细胞仪对丝状蓝藻检测不足的缺点。

3 结论

(1)通过流式细胞仪和高通量测序技术的联用，实现了超微藻检测方法体系的构建。流式细胞仪对超微藻群进行识别、计数和分选，23S rDNA高通量测序得到超微藻种属信息，从而深入探究超微藻群落结构在时间和空间上的动态变化规律。

(2)通过对取自上海金泽水库实际水体样本中超微藻的分析，检验了此方法的可行性和有效性。分选操作和高通量测序方法的优化极大减少了异养模版的干扰，获得更多的超微藻序列，大大提高低相对丰度藻属的检出率。

(3)金泽水库夏季水体中超微藻数量在103～105cell/mL，共检出6个门类的超微藻，包括蓝藻、绿藻门、不定鞭藻、异隐藻、定鞭藻和囊泡藻，超微藻的多样性较高。