细颗粒物PM2.5对大鼠IL-10、IL-22 表达的影响及百令胶囊的干预作用

张宁，田硕，林桦，李萍，牛姝，苏力，平芬

空气污染是当今人类面临的问题，也是引起呼吸系统疾病的主要原因之一，其主要原因是现代工业的发展和汽车尾气的过量排放[1]。空气中颗粒物(particulate matter，PM)分为超细(≤0.1 μm)、细(≤2.5 μm)、粗(≤10 μm)及颗粒[2]。由于PM分散均匀，在空气中停留很长一段时间，因此其可渗透到呼吸系统的最深处，此外，由于PM2.5表面积大，它可以与金属、重金属、多环芳烃、类金属、元素碳、病毒、细菌、真菌孢子、内毒素、水溶性离子盐等结合，长期和短期暴露在PM2.5中与一系列负面健康后果有关，包括呼吸系统疾病、生殖系统疾病、心血管疾病、血液系统疾病、生存期的减少，全世界死亡总人数约7.6%(4 200万)与PM2.5接触有关[3-5]。

发酵虫草菌粉是百令胶囊的主要生物成分，其具有多种药理作用，已被用于呼吸系统疾病的治疗，如咳嗽、气喘、慢性支气管炎肺气肿、肺间质纤维化等[6]。同时也证明其能抑制炎性反应，防止许多器官的缺血性损伤[7]。现通过观察PM 2.5 及百令胶囊对大鼠血清白介素 10(interleukin，IL-10)、IL-22含量及mRNA水平的影响，进一步证实百令胶囊对大鼠肺损伤的抗炎作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只清洁级Wistar雄性大鼠，180～200 g，购自河北医科大学实验动物中心(动物质量合格证：1912162)，研究前1周适应动物房间条件，动物在室温23～25℃和相对湿度25%～30%下保持12 h的光/暗循环。实验过程中根据实验动物管理和保护有关规定进行操作。

1.2 PM2.5悬液配制 2019 年5—8月期间用大流量采样器采用玻璃纤维滤膜(河北省故城县环境检测器材厂生产)采集大气PM2.5细颗粒物。细颗粒物滤膜剪切成 1 cm×2 cm长方形小条，置于去离子水中，使用超声波清洗器(型号:JL-120DT，昆山超声仪器有限公司生产)洗脱，3 000 r/min离心20 min，4℃冷冻真空干燥，收集粉末留待备用。临用前，称取一定重量的PM2.5，用生理盐水配制成相应浓度的 PM2.5混悬液，超声震荡混匀，4℃保存。

1.3 实验动物分组及给药方法 2019年9—10月于河北省人民医院动物研究中心进行实验，40只大鼠随机数字表法分为5组，分笼饲养。分别标记为空白对照组、PM 2.5染毒组及PM2.5+低、中、高剂量百令胶囊给药组(百令胶囊购自河北省人民医院)。PM2.5染毒大鼠通过气管滴注浓度为10 mg/kg PM2.5混悬液进行造模，每3天1次，共染毒 10 次；PM2.5+百令胶囊给药组：给予百令胶囊灌胃(滴注细颗粒物期间同时给予药物)28 d，灌胃剂量分别为 0.25、0.5、1.0 g/kg。

1.4 标本采集 末次染毒24 h后，予大鼠腹腔内注射10%水合氯醛(0.30 ml/kg)麻醉，腹主动脉采血，全血以3 000 r/min离心10 min，提取血清，-80℃冰箱保存。处死大鼠后取肺脏，4%多聚甲醛固定右肺下叶组织，石蜡包埋，切片(片厚3～4 μm)，进行HE染色，光镜下观察肺组织炎性病理改变。左下肺组织冻存备用。

1.5 ELISA法检测大鼠血清IL-10、IL-22蛋白 采用酶联免疫法(ELISA)检测血清IL-10和IL-22蛋白含量，严格按照试剂盒说明书操作(试剂盒购自美国 BG 公司)。

1.6 实时荧光定量PCR(QRT-PCR)法检测大鼠肺组织IL-10、IL-22 mRNA表达 采用TRNzol总RNA提取试剂(北京天根科技公司生产)进行样本RNA提取，PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,北京天根科技公司生产)进行cDNA反转录，再进行PCR扩增。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参，IL-10上游引物序列：5’-CTTTAAGGGTTACTTGGGTTGC-3’；下游引物：5’-CCACTGCCTTGCTTTTATTC-3’，扩增产物全长200 bp；IL-22上游引物序列：5’-TACTATGGGAGGGTGATG-3’；下游引物：5’-GTTTGGTTTCTATGTGGC-3’，扩增产物全长156bp。每个样本检测3个复孔，数据采用2-△△ CT法进行分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织病理变化比较 光镜下，空白对照组大鼠肺组织未见明显炎性反应；PM2.5染毒组可见大量慢性炎性细胞浸润，肺泡间隔明显增宽，宽窄不一，肺间质内血管扩张，肺泡腔内无明显渗出物；高剂量百令胶囊干预组较PM2.5染毒组炎性细胞浸润情况明显减轻，低剂量及中剂量百令胶囊干预组病理表现介于PM2.5染毒组及高剂量百令胶囊干预组之间，见图1。

2.2 各组大鼠血清 IL-10、IL-22水平比较 PM2.5染毒组大鼠血清IL-10水平明显低于空白对照组(t=27.758，P=0.000)，IL-22水平明显高于空白对照组(t=28.190，P=0.000)。与PM2.5染毒组比较，百令胶囊各干预组随剂量的增加，血清IL-10水平逐渐升高(F=224.867，P=0.000)，而血清IL-22水平则逐渐下降(F=149.115，P=0.000)，见表 1。Pearson相关分析表明，血清IL-10 和IL-22水平呈负相关(r=-0.960，P<0.01)。

表1 各组大鼠血清IL-10、IL-22水平比较

2.3 各组大鼠肺组织IL-10、IL-22 mRNA表达比较 RT-PCR 结果显示；PM2.5染毒组大鼠肺组织IL-10 mRNA表达明显低于空白对照组(t=61.342，P=0.000)，IL-22水平明显高于空白对照组(t=-55.298，P=0.000)。与PM2.5染毒组比较，百令胶囊干预组随剂量增高，肺组织IL-10 mRNA表达升高(F=1 131.931，P=0.000)，IL-22 mRNA水平则呈下降趋势(F=604.257，P=0.000)，见表2、图2。

注：A.空白对照组;B.PM2.5染毒组;C.低剂量百令胶囊干预组;D.中剂量百令胶囊干预组;E.高剂量百令胶囊干预组图1 各组大鼠肺组织病理表现(HE染色，×200)

表2 各组大鼠肺组织IL-10、IL-22 mRNA表达水平比较

注：与空白对照组比较，aP<0.01；与PM2.5染毒组比较，bP<0.05；与低剂量百令胶囊干预组比较，cP<0.05；与中剂量百令胶囊干预组比较，dP<0.05图2 各组大鼠肺组织IL-10、IL-22 mRNA表达比较

3 讨 论

颗粒物是大气污染物的主要组成部分，它可导致急性或慢性呼吸系统疾病，如急性支气管炎、支气管哮喘、肺癌等，也可以引发慢性呼吸系统疾病加重，但其对人类呼吸系统的毒性影响及确切机制并不明确[8]。颗粒可能通过提高气道反应性、促进氧化应激、引起炎性反应、降低宿主免疫防御机制，从而导致肺部疾病的发生或恶化[9-10]。

百令胶囊是由发酵冬虫夏草菌粉组成的人工制剂，与天然虫草主要成分一致。百令胶囊还富含氨基酸、核苷酸、虫草酸、虫草多糖等物质，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多重作用[11-12]。目前通过体外试验证明，冬虫夏草是一种免疫调节活性成分，可增加抗炎因子的表达[13-14]。

肺部炎性反应是导致肺部疾病(包括肺损伤)发病的中心效应[15]，包括T细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞等多种免疫细胞，以及它们释放的细胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α、IL-10等参与炎性反应和组织损伤[16]。

IL-10细胞因子家族包括IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26，被认为是2α螺旋细胞因子。其中IL-10是最重要的抑制细胞因子，可以抑制炎性反应、限制过度免疫反应[17]。IL-10是NF-κB的一种强有力的抑制剂，其抗炎活性主要是通过这种方式介导的，另外，STAT 1/SOCS-3信号通路的激活是IL-10的另一抗炎机制[18]。本研究结果提示，PM2.5染毒组IL-10水平明显低于空白对照组，百令胶囊干预组IL-10水平明显高于PM2.5染毒组，提示百令胶囊可能通过上调IL-10减轻PM2.5导致的炎性反应。

IL-22是新近报道的IL-10细胞因子家族中的一员，IL-22与IL-10结构相似，两者共用IL-10R2链，CD4+T辅助细胞、γδT细胞、自然杀伤(NK)T细胞和第3组固有淋巴样细胞(ILC 3)通常是IL-22的主要细胞来源[19]。IL-22的表达具有异质性，Starkey等[20]发现轻度至中度COPD患者气道上皮细胞中IL-22和IL-22RmRNA的表达增加，而在重度COPD患者中无明显变化。IL-22在哮喘中具有双重作用，它能在临床前模型中促进哮喘的发生，但能减轻抗原抗体免疫反应和恶化时的炎性反应[21]。IL-22的双向作用，取决于细胞因子环境或者疾病的病理状态，主要通过STAT3信号途径发挥生物学作用[22]，本研究发现，IL-22在PM2.5染毒组中明显升高，中、高剂量百令胶囊干预组IL-22 水平明显低于MP2.5染毒组，提示百令胶囊可能通过下调IL-22来拮抗PM2.5导致的肺损伤。

本研究结果表明，PM2.5可导致肺部炎性反应，而IL-10及IL-22分别是PM2.5介导炎性反应的重要抗炎介质及炎性介质，两者具有相反的生物学活性，百令胶囊可能通过促进IL-10的分泌，以及抑制IL-22的生成，对肺部起到保护作用，但是其中机制，尚需未来进一步的深入研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

张宁：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；田硕、牛姝：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改;林桦、李萍：提出研究思路，分析试验数据，论文审核;苏力：进行统计学分析;平芬：课题设计，论文撰写