肉桂种子生物学特性及生活力研究

钟 磊， 钱家萍， 蔡启忠， 王 敏， 张慧晔， 杨 全， 罗 碧

(1.广东药科大学中药学院， 广州 510006；2.国家中医药管理局岭南药材生产与开发重点研究室，国家中药材产业技术体系广州综合试验站，广东省南药规范化种植与综合开发工程技术研究中心， 广州 510006；3.广州白云山和记黄埔中药有限公司， 广州 510006)

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)又名桂，为樟科樟属常绿乔木，主产于广东、广西、云南等地区，干燥树皮(桂皮)、小枝(桂枝)、果实(桂子)均可入药[1]，桂皮具有补火助阳，引火归元，散寒止痛，温通经脉的功效[2]。肉桂的繁殖方式有种子繁殖、萌蘖繁殖和扦插繁殖，其中种子繁殖得到的肉桂幼苗根系发达、生命力顽强。肉桂种子属于顽拗性种子[3]，具有脱水敏感性，即种子含水量低于某个临界点时，种子活力会迅速丧失，保存难度大，只能随采随播[4]，因此对肉桂种子研究较少。大田育苗为传统的肉桂育种方式，但发芽率并不高。前人对肉桂种子催芽方式进行了研究，彭寿强等[5]研究发现，水洗催芽的肉桂种子发芽率显著高于沙藏催芽。李开祥等[6]发现，适当浓度GA3浸泡后的肉桂种子发芽率明显高于对照，且在18～20 d发芽率最高，达到90%。

随着肉桂产业的不断发展，人工栽培面积的不断扩大[7]，肉桂种子成为了种苗繁育最基本最重要的生产资料，而通过发芽率评价肉桂种子的质量存在时间长、检验难度大的问题。种子生活力测定能快速鉴定种子发芽能力，预测种子在发芽和出苗时的活力，是种子质量检测的重要方式之一。雷慧霞等[8]通过正交试验设计确定了TTC法快速测定白鲜种子的最佳条件。马洪娜等[9]通过响应面分析法优化了TTC法测定山豆根根种子生活力条件，且实验结果与正交试验和单因素试验结果一致。目前对肉桂种子的贮藏方式、苗木繁育、栽培方法等方面有所研究，但未见对肉桂种子生物学特性及生活力测定研究。本实验对肉桂种子形态特征、千粒重、含水量、萌发特性、生活力测定等方面进行研究，以期找到较高发芽率的种子萌发方法及最佳的生活力测定条件，为肉桂种子质量控制和种苗繁育技术研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

2019年3月至4月，采集广东云浮市罗定市榃滨镇(22°48′43″N，111°24′16″E)三十生肉桂母树的成熟肉桂种子作为试验材料，经广东药科大学中药学院刘基柱副教授鉴定为肉桂(CinnamomumcassiaPresl.)植物种子。

1.2 方 法

1.2.1外观形态观察

将采摘回来的肉桂种子去掉果皮，观察并描述种子的颜色、形状、质地等外观形态。随机取30粒种子，用游标卡尺(精密度0.01 mm)测量肉桂种子长度和直径，并记录数据。

1.2.2千粒重和含水量的测定

根据(GB/T 3543.7-1995)《农作物种子检验规程》[10]，采用千粒重法测定肉桂种子的千粒重。根据(GB 2772-1999)《林木种子检验规程》[11]测定肉桂种子含水量。

1.2.3不同萌发方式对肉桂种子发芽率的影响

设计4个萌发方式处理，分别为培养皿萌发、水洗催芽法、湿沙萌发、干沙萌发，每隔5 d统计发芽数，每个处理3次重复。

1.2.4种子生活力测定的正交试验设计

根据《国际种子检验规程》[12]，采用三苯基氯化四氮唑(TTC)法测定肉桂种子生活力。为确定肉桂种子生活力测定的最佳条件，本实验采用三因素三水平的正交试验L9(33)设计法比较TTC浓度、染色温度和染色时间等因素对种子生活力的影响(表1)。

表1 TTC测定因素和测定水平

1.2.5种子的预处理和生活力判断

取50粒肉桂种子，用蒸馏水浸泡6 h，使种子充分吸水，用滤纸吸干表面的水分，并沿种子长轴纵向切开成两半，使其胚露出，然后将种子置于装有TTC溶液的棕色瓶中，放置在已设定好温度的水浴箱中染色。每个处理重复3次。

肉桂种子生活力的判断标准参照《国际种子检验规程》[12]，胚的主要组织染成粉红色或红色即为有活力的种子，按以下公式计算种子生活力：

种子生活力(%)=(染色数目/种子数目)×100%。

1.3 数据分析

使用Excel 2016软件、SPSS 23.0软件进行数据分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 种子形态特征

成熟的肉桂种子呈紫黑色，卵形至长卵形，种皮坚硬，表面光滑且具有蜡质光泽，种柄延伸方向有8～13条突起的棱；种子长度为7.91～12.78 mm，直径为6.34～7.67 mm。肉桂种子千粒重平均值为262.41 g，标准差为1.73，变异系数(CV)为0.007；种子含水率平均值为35.99%，标准差为2.67，变异系数为0.074(表2)。

表2 肉桂种子千粒重及含水量

2.2 不同萌发方式对肉桂种子发芽率的影响

不同萌发方式对肉桂种子发芽率的影响如图1所示，培养皿萌发、水洗催芽和湿沙萌发这3种萌发方式的大部分肉桂种子均在前15 d发芽，其中在湿沙条件下发芽率最高，为76.67%，培养皿萌发和水洗催芽条件下的萌发率分别为68.67%和51.2%，干沙条件下的肉桂种子几乎不发芽。

2.3 肉桂种子生活力测定结果

由表3可见，肉桂种子生活力最高为98.67%，对应的染色条件为TTC浓度为1%、染色温度为35 ℃、染色时间为8 h，此条件下大部分肉桂种子的胚或胚根均被染成红色或粉红色；种子生活力最低为23.33%，对应的染色条件为0.1%、染色温度为25 ℃、染色时间为4 h，此条件下肉桂种子胚或胚根大部分未被染色。

2.4 极差分析

由表3可见，TTC浓度的极差值最大，R=48.889，染色时间的极差最小，R=13.333。因此影响肉桂种子生活力的因素主次为TTC浓度>染色温度>染色时间，即在染色时TTC浓度和染色温度为主要影响因素，而染色时间对其影响相对较小。

表3 正交实验TTC法测定肉桂种子生活力

2.5 方差分析

进一步对数据进行方差分析(表4)，可以看出，试验中3个因素对试验结果都具有极显著差异(p<0.01)，说明TTC浓度和染色温度是肉桂种子活力测定的重要因素。

比较各因素不同水平下肉桂种子生活力平均值(表5)，TTC浓度、染色温度和染色时间在第3水平下的平均种子生活力是最大的，分别为85.78%、79.11%和73.78%。且各因素下不同水平之间的平均种子生活力差异显著(p<0.05)。因此肉桂种子生活力测定条件初步认为TTC浓度为1%，染色温度为35 ℃，染色时间为12 h。

表5 各因素不同水平肉桂种子生活力平均值比较

2.6 肉桂种子生活力测定适宜条件验证

对正交试验中未出现TTC浓度为1%、染色温度为35 ℃、染色时间为12 h的试验组进行染色条件验证，结果如表6所示。种子平均生活力为96.67%，较方差实验的第9组低，且染色时间较长。因此肉桂种子生活力测定条件为TTC浓度为1%、染色温度为35 ℃、染色时间为8 h。

表6 肉桂种子生活力的验证

3 结果与讨论

3.1 种子形态特征和萌发特性

肉桂成熟种子呈紫黑色，卵形或长卵形，种皮坚硬，种柄延伸方向有8～13条突起的棱；种子长7.91～12.78 mm，直径6.34～7.67 mm，千粒重平均值为262.41 g，种子含水量平均值为35.99%。肉桂种子成熟时，种皮的颜色由紫黑色转为黑褐色，萌发时种子顶端稍微裂开，胚根露出。本研究结果表明，不同萌发环境对肉桂种子萌发率有很大的影响，发芽率顺序为湿沙萌发>培养皿萌发>水洗催芽>干沙萌发。田云等[13]发现，姜黄种子在湿沙条件下的萌发效果较滤纸培养皿。本研究结果与之一致，说明湿沙能较好保持种子的含水量，有利于种子萌发。而通过水洗催芽技术发现，肉桂种子的萌发效果比较差，在操作过程中发现种子表面极易霉变且种皮易破，这与彭寿强等[5]研究结果不一致，原因可能是在阴凉通风处放置时种子表面的水分容易蒸发，且与发芽床中温度相比，较大的室温变化会影响种子的萌发。

3.2 TTC法测定肉桂种子生活力的最佳条件

种子质量是药材产量和品质的重要基础和前提，而种子发芽率是检测种子质量的重要指标之一[14]。通过种子发芽率来判断肉桂种子的质量过程较长，许勇等[15]研究表明，肉桂种子播种后至少需要30 d基本发芽；李开祥等[6]研究发现，在GA3浸种下的肉桂种子萌发率虽然得到了显著的提高，并缩短发芽时间。TTC法检测种子生活力是一种能快速判断种子萌发潜力和质量的有效方法，现已在多种药用植物种子质量检测中广泛运用[16]，但不同植物种子的TTC法最佳测定条件不同，如明孟碟等[17]采用TTC染色法测定天师栗种子生活力的最佳条件为0.2%TTC溶液避光染色11～13 h，刘雅岚等[18]通过TTC染色法分别确定了榄仁树、水黄皮、银合欢、见血封喉、黄槿等5种热带林木的种子生活力，结果表明，各种种子的染色温度、染色时间和TTC浓度均不相同。本试验中，正交设计组合9中的肉桂种子生活力达到98.67%，为正交试验中最佳的染色条件，即肉桂种子在35 ℃条件下浸泡在1% TTC溶液避光染色8 h。虽然通过数据方差分析初定肉桂种子在35 ℃条件下1%的TTC溶液避光染色12 h为较优方案，但是该方案与组合9比较，染色时间较长，且染色效果不及组合9。极差分析表明，TTC浓度和染色温度是影响肉桂种子生活力的较重要的因素，而染色时间对生活力的测定影响较小，因此处理9可以作为最优组合。综上所述，肉桂种子生活力测定的最佳条件为TTC浓度为1%、染色温度为35 ℃、染色时间为8 h。

3.3 TTC法测定肉桂种子生活力的可行性

相关研究表明，通过TTC法测定种子生活力的结果一般大于或等于发芽率。罗光明等[19]研究发现，TTC染色法测定的车前子种子生活力与发芽率呈显著的正相关。钟淑梅等[20]研究发现，独活种子生活力显著高于发芽率，且两者之间呈极显著相关性；彭云霞等[21]研究发现，小叶黑柴胡种子生活力和发芽率具有明显的线性关系。本研究中肉桂种子生活力最高为98.67%，发芽率为76.67%，种子的生活力高于发芽率，这可能是因为种皮含有萌发抑制物导致了种子休眠。杜会聪等[22]研究表明，腊梅种子的种仁和种皮中的萌发抑制物能显著抑制白菜种子的萌发及芽和根的生长。李询等[23]研究表明，多花黄精种子种皮中含有较多的萌发抑制物，具有抑制种子萌发和幼苗生长的作用。同时因为肉桂种子含多油性物质且易失活的特点，因此萌发环境对种子的发芽率影响也很大。本研究通过TTC法测定肉桂种子生活力需要8 h，而通过萌发实验测定肉桂种子发芽率则需要至少15 d。因此在实际生产中可先采用TTC法测定肉桂种子的生活力来判断肉桂种子潜在的发芽能力并了解种子的质量。