鸡马立克氏病活疫苗（814株）免疫失败的因素

陈伯斯，高 尚，张宏斌，王堂花，杨汶菱

（海鸿农牧（广州）有限公司，广东 广州510000）

马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）是少数几种能在自然宿主中诱导产生肿瘤的疱疹病毒之一，属于疱疹病毒科疱疹病毒亚科。由其引起鸡马立克氏病可以普遍发生在病鸡的各种组织和器官中，以外周神经淋巴样细胞浸润和包括虹膜、皮肤在内的各种器官和组织的单核细胞浸润、肿大，进而形成肿瘤为主要特征，给鸡群带来的发病率一般为1%～30%不等，有时甚至可高达60%。

在现在以及可预见的未来，疫苗接种是防控MD的中心策略。随着MDV毒力在过去几十年间的不断增强，致使疫苗的使用也在发生改变，HVT等冻干苗使用量在不断减少。目前，国内广泛使用的马立克氏病活疫苗主要包括CVI988-Ris pens株及814株。虽然马立克氏病活疫苗的免疫已经相对成熟，但临床免疫中却往往出现免疫失败的现象。本文通过814株的病例追踪并结合生产实际，总结了该疫苗免疫失败的原因，为同行免疫该疫苗提供依据。

1 疫苗及稀释液的保存运输

由于马立克氏病病毒是一种严格的细胞结合性病毒，所以由其制成的活疫苗，必须严格保存在－196℃的液氮中，任何使得疫苗暴露在液氮之外的操作都会引起疫苗溶解而失效。这就要求疫苗在运输过程中必须保证液氮罐直立状态，并减少碰撞。接收疫苗的第一时间，需要检查液氮面是否位于疫苗之上，否则弃用。由于在日常使用中需要反复打开液氮罐口，导致液氮挥发，为保证疫苗质量，日常管理中需要及时检查液氮高度并添补液氮。

稀释液作为稀释疫苗的溶液，可避光常温保存。因其具备很高的营养成分，容易受到病原微生物的污染，所以在运输及保存过程中需要严格筛除包装破损、溶液浑浊变色的稀释液。目前，不同厂家稀释液的配制方法不同，对疫苗的保护效果也不同。以科前生物公司的马立克氏病疫苗（814株）专用稀释液为例，稀释配套疫苗40min后检测效价，疫苗的损失率在5%之内，而改变配方成分的稀释液和进口稀释液在稀释完疫苗的40min内，疫苗的损失率在30%～50%。可见为保证免疫效果，切不可混用不同厂家的稀释液。

2 疫苗免疫

2.1 免疫前准备

在免疫前，需要检查疫苗的规格。目前马立克氏病（814株）疫苗具备2000羽/瓶及1000羽/瓶两种规格，若将1000羽份规格错当2000羽份使用，则会造成免疫的蚀斑数降低，引起免疫失败。取出规范保存的疫苗后，首先需要观察安瓿瓶瓶身的完整性，对出现瓶身不完整疫苗，应当废弃处理。若观察发现安瓿瓶小头端有疫苗残留，说明该瓶疫苗出现冻融情况，也应废弃处理。稀释液则检查包装完整性及液体是否澄清，若是冷藏保存，则应在稀释前回温至37℃。

取出的疫苗应立即放入预先调好的37℃水浴锅中溶解，整个过程控制在5s左右。手指捏住安瓿瓶小头端，按一个方向做缓速圆周划动，使疫苗受热均匀溶解，并在45s内溶解完疫苗。使用5mL注射器吸取3mL稀释液，再缓慢吸出疫苗并注入稀释液中。反复3次吸取稀释液洗涤瓶身，以减少疫苗损失。从取出疫苗到稀释完成，整个过程应控制在2min以内，时间过长则会降低疫苗效价。

2.2 免疫操作

免疫过程的时间长短决定了免疫的效果。有研究表明，室温存放时间对马立克氏病（814）疫苗的蚀斑单位及病毒存活率有影响，存放时间越长，容易造成免疫失败。马立克氏病（814）液氮疫苗生产厂家对2000羽份规格疫苗不同存放时间下的蚀斑单位计数及病毒存活率进行比较试验。结果表明，室温存放超过45min即对疫苗蚀斑单位及病毒存活率造成很大影响（见表1）。

表1 室温存放MD疫苗的蚀斑单位计数及病毒存活率

因此，针对2000羽份规格的疫苗免疫时间应控制在45min内，1000羽份规格的疫苗免疫时间应控制在30min以内。在免疫过程中，细胞的沉降特性会使细胞逐渐向疫苗瓶的底部沉降，为保证免疫的均一性，需要在免疫过程中每隔10min轻轻摇晃疫苗瓶，以维持细胞的均匀悬浮。同时，免疫部位位于雏鸡的颈背部皮下，漏打错打均会引起免疫失败甚至雏鸡的死亡，需要定期对操作人员进行培训。

3 抗生素添加

现场临床经验表明，疫苗免疫操作问题，会使疫苗部分或全部失效，这是当下免疫失败的重要原因。此外，多数养殖场在疫苗中添加抗生素的例子已不罕见。但有些抗生素能够改变稀释液的渗透压和pH值，加快疫苗的灭活。根据武汉科前生物有限公司实验室检测结果分析，受试抗生素绝大多数能够对马立克氏病（814）疫苗产生影响，且不同厂家生产的同种抗生素影响效果不同（见表2）。

表2 不同抗生素对马立克氏病（814）疫苗效价的影响

本厂曾送检丁胺卡那霉素至实验室，以检测其对疫苗的影响。结果发现，稀释液在加入该抗生素后明显变黄（见图1），pH值与渗透压明显变化，蚀斑单位影响较大（见表3）。

表3 丁胺卡那霉素对马立克氏病活疫苗（814株）的影响

图1 丁胺卡那霉素加入至稀释液后表观变化

因此，为确保免疫效果，在添加抗生素前，应送至相关机构进行检测，选择影响效果较小的抗生素使用。

4 遗传背景

家禽的抗性以及抗病特征早在上世纪30年代就被育种科学家认知，但对于抗病力的研究远落后于经济性状的研究。对鸡抗MD的研究，主要集中在主要组织相容性复合体（MHC）上。MHC是存在于脊椎动物的染色体上，编码主要组织相容性抗原、控制细胞间的相互识别以及调节免疫应答的一组紧密连锁基因群。研究证实，MHC分子在动物的免疫系统中发挥着重要作用，其不同单倍型与动物疾病的抵抗力和生产性能有着密切的联系。Hansen通过血型B19和B21组合杂交，感染MD后发现B21为优势基因。Briles等也通过试验证明B21单倍型的抗病力最强。Bacon指出：在抗马立克氏病中，抗性最强的是B21单倍型，中等抗力的的是B2、B6单倍型。易感的是B5、B13及B19单倍型。有研究通过选取24个鸡种进行目标捕获测序，发现了其与MD的抗性关系（见表4）。

表4 不同鸡种的MHC单倍型及与MD抗性关系

上表显示了不同鸡种对MD的不同抗性，提示易感及中等抗性鸡种相对强抗性鸡种更易感MD。同时，大部分地方鸡种含有B21单倍型，相对于商业鸡种来说显示出较强抗性及疾病死亡率，临床实际也表明商业鸡种，例如海兰蛋鸡更易感MD，或与遗传背景有关。

5 其他因素

在临床MD免疫失败经验中，除了上述因素外，还有其它因素也在影响着马立克氏病活疫苗（814株））的免疫效果。笔者通过追溯免疫失败案例，进行实验室检测分析病死原因，发现绝大多数病死鸡除患有MD外，还并发有禽白血病、网状内皮组织增值病及肝炎-脾脏肿大综合症等免疫抑制疾病。因此，养殖场需要密切关注免疫抑制疾病的发生，避免此类疾病降低机体免疫能力，给MDV的感染提供机会。

对饲养期较短的商品肉鸡，由于不易观察到MD典型症状，致使部分肉鸡养殖者忽视MD疫苗的重要性，这是造成目前MD疫苗在我国商品肉鸡中流行较为严重的原因之一。调查显示，我国商品肉鸡MD死亡率高达5%，因早期感染MD表现严重免疫抑制或“早期急性死亡综合症”的所占比例是20%～25%。这些情况不仅致使鸡群生长缓慢，易患其他疾病，甚至能够衰弱其他疫苗的免疫效果。而随着带毒鸡不断排出羽屑上皮组织，存在于羽毛上皮碎屑中的MDV也随之增加，从而造成环境中MDV毒量的累积，甚至出现了超超强毒株（vv+MDV）。目前，超超强毒株能够突破免疫保护，引起免疫过MD的鸡群发生该病，形成免疫失败。因此，注重马立克氏病的防制措施及严格的生物安全制度是降低免疫失败的关键。

6 结束语

由于MD（814株）疫苗的使用，使我国暴发该病的病例在过去10年间已经明显减少。但疫苗并不能完全防止MD的发生，多种原因均可以引起免疫失败。本文揭示临床免疫MD失败的部分原因，包括疫苗保存运输不当、免疫操作不当、抗生素影响效果、鸡种遗传背景、免疫抑制病共生及超超强毒株出现。此外，还有疫苗质量、母源抗体影响、免疫空白期等其他因素也可以引起免疫失败。随着养鸡业集约化程度不断提高，只有我们重视该病，积极预防，做好防控的每一环节，才能降低免疫失败比率，营造健康的养殖环境。