添加单宁酸对青贮葛藤有氧稳定性和霉菌毒素含量的影响

杨冬梅，李俊年，陶双伦

（吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首416000）

葛藤（Pueraria lobata）为蝶形花科葛藤属，是多年生藤本植物。葛藤再生能力强，枝繁叶茂，每年藤蔓可伸长10 m以上，每年可刈割3~4次，葛藤鲜草产量5万~6万kg·hm-2。葛藤茎叶中粗蛋白含量为20.89%~29.20%［1-2］。同时，葛藤中所含葛根素、黄酮、甙元等生物活性物质，可提高动物机体免疫力，具有促进性腺、生殖功能、副性器官的发育和第二性征出现的作用，能缓解和防治由应激原引起的应激综合症［3］。我国西南地区各省均在大力推广种植葛藤，生产葛粉，附加产生的大量葛藤茎叶，是牛羊的最佳饲料［4-5］。但西南地区气候潮湿，晾晒的牧草易发霉变质，进行葛藤茎叶青贮是解决其发霉变质的有效途径［6］。加之葛藤茎叶含水量大、蛋白质含量高且碳水化合物含量低，这些特性易导致青贮葛藤发酵期间的养分流失，降低青贮品质［4，6］。因此，选择适宜的青贮添加剂提高葛藤青贮发酵品质显得尤其重要。

单宁酸（tannic acid，TA）是具有还原性和抗氧化性的有机酸，具有杀菌、防腐、凝固蛋白质的作用［7-8］。在青贮饲料中添加单宁酸可迅速降低青贮饲料p H值，抑制杂菌的繁殖，降低氨态氮和总酸的含量，从而改善青贮饲料的品质［9-10］。单宁酸在动物消化道内部可与植物蛋白形成复合物，提高反刍动物过瘤胃蛋白，从而提高饲料中养分的可利用率［11-13］。同时，诸多研究也已表明，单宁酸能抑制小白鼠表皮与大肠多环芳香烃的诱变作用和肿瘤增生的作用，降低血脂清除自由基，将其应用于青贮过程中，以替代对人体健康具有潜在威胁的CH2O和CH2O2［14］，有助于生产绿色健康的有机畜产品。

青贮时添加单宁酸能降低p H，改善青贮品质，被应用于苜蓿（Medicago sativa）、象草（Pennisetum purpureum）、黑麦草（Lolium perenne）等青贮调制［15-18］。迄今，单宁酸应用于葛藤茎叶青贮中的报道较少，仅杨冬梅等［19］将3%和4%单宁酸添加在青绿葛藤茎叶中，青贮60d后添加单宁酸的葛藤茎叶青贮饲料质地松散完整，具有酸香味，干物质损失率显著降低；可溶性碳水化合物和中性洗涤纤维含量显著增加，但未深入检测单宁酸对青贮葛藤茎叶品质及安全性的影响。本研究拟探讨不同浓度单宁酸对青贮葛藤茎叶发酵品质、有氧稳定性及霉菌毒素含量的影响，为西南山区葛藤茎叶的科学利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 青贮原料

新鲜葛藤茎叶采自湖南湘西土家族苗族自治州古丈县断龙乡杨家寨。采样区海拔800~1200 m，地理坐标为东经109°10′-110°22.5′，北纬27°44.5′-29°38′。采样区气候属亚热带季风湿润气候区，年平均气温15.0~16.9℃，最高气温40.5℃，最低气温-5.5℃。年降水量1300~1500 mm，无霜期250~280 d。年平均相对湿度77%，平均日照1397.2 h。

1.2 青贮制作

葛藤收获后立即运往吉首大学生态研究所。将葛藤切割成2 cm左右小段，将水分含量调至60%~70%，以手握切碎的青贮料，手指缝中略有水为青贮料含水适中，没有水为过干，适当匀撒些水，水分过多的通过晾晒达到水分适当。

添加单宁酸的比例参照李茂等［17］和杨冬梅等［19］的方法，并结合以前的预试验。其中，单宁酸的添加浓度分别为0、1.0%、1.5%、2.0%（4个处理，处理组编号分别为对照组，1.0%TA，1.5%TA，2.0%TA），然后装入塑料袋，每袋净重500 g，每个处理15袋。用真空包装机抽空塑料袋中的空气，随即密封并存放在干燥的室内。

1.3 样品采集

青贮第5、10、35、50和70天分别采集样品，按照4分法采集，一部分（100 g）青贮葛藤样品直接保存于-80℃，用于霉菌毒素含量的测定；另一部分（25 g）加180 mL蒸馏水，榨汁机搅拌捣碎后用2层纱布和定性滤纸过滤得浸出液，所得浸出液一份于-80℃保存，用于发酵品质的测定，另一份进行10-1~10-7梯度稀释，采用平板计数法测定微生物的数量。在添加放线菌酮（200μg·mL-1）的MRS肉汤培养基（蛋白胨10.0 g·L-1，肉膏10.0 g·L-1，酵母提取物5.0 g·L-1，葡萄糖20.0 g·L-1，磷酸氢二钾2.0 g·L-1，柠檬酸氢二铵2.0 g·L-1，乙酸钠5.0 g·L-1，硫酸镁0.58 g·L-1，硫酸锰0.25 g·L-1，半胱氨酸0.5 g·L-1，吐温80 1.0 g·L-1）中检测乳酸菌数量，再在灭菌酒石酸调pH至3.5的马铃薯琼脂培养基中检测酵母菌数量。乳酸菌MRS琼脂平板在37℃厌氧条件下培养24~48 h，酵母菌马铃薯琼脂平板在37℃下培养48~72 h。

1.4 有氧稳定性

青贮50 d后，从每个青贮袋中取30 g样品放入干净的80 mL青贮瓶中，覆盖2层纱布，在室温下保存。取出的样品在0，5及10 d进行一次取样（10 g），测定p H，分析乳酸含量以及酵母菌的数量。有氧稳定性采用p H等指标进行分析，每个样品3个重复。

1.5 样品分析

参照张丽英［20］的方法测定样品营养成分。采用烘干法测定干物质（dry matter，DM）含量；采用凯氏定氮法测定粗蛋白（crude protein，CP）含量［21］；采用ANKOM 220纤维分析仪（ANKOM，美国）测定中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量［22］；参照余汝华等［23］的方法测定可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrate，WSC）含量；采用苯酚-次氯酸钠比色法［24］测定氨态氮（NH3-N）含量。用雷磁PHS-3C型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）测定pH值。采用岛津LC-20A型高效液相色谱仪测定乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）含量，重复3次。

用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定样品中黄曲霉毒素（aflatoxin，AF）、呕吐毒素（vomitoxin，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）含量，重复3次，试剂盒购自上海逸峰生物科技有限公司。

1.6 统计分析

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，采用单因子和双因子方差分析（青贮时间×单宁酸添加量，有氧暴露时间×单宁酸添加量）进行处理组间差异比较，并采用Duncan氏法进行多重比较，数据用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

随着青贮时间的延长，青贮葛藤茎叶粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量均有所下降（表1），但差异不显著（P>0.05），可溶性碳水化合物含量显著降低（P<0.05），青贮时间和单宁酸添加量对可溶性碳水化合物含量具有显著的交互作用（P<0.05）。葛藤茎叶青贮50 d后，在2.0%单宁酸处理条件下可溶性碳水化合物含量和中性洗涤纤维含量较对照组显著增加（P<0.05），粗蛋白含量虽有所增加，但差异不显著。葛藤茎叶青贮70 d后，添加2.0%单宁酸的可溶性碳水化合物含量较对照组提高16%（P<0.05）。

表1 添加单宁酸对青贮葛藤茎叶营养成分的影响Table 1 Effect of tannin acid addition on the nutrient content of silage kudzu vine

葛藤茎叶青贮50 d后，添加单宁酸对青贮葛藤茎叶中乙酸含量、氨态氮含量、乳酸菌数量均无显著影响（P>0.05）。单宁酸处理组未检出丙酸和丁酸。而随着葛藤茎叶青贮单宁酸添加量的增加，乳酸含量显著下降（P<0.05）。各处理组酵母菌数量均低于2.00 lg CFU·g-1FM（表2）。

表2 添加单宁酸对青贮葛藤茎叶发酵参数的影响Table 2 Effects of addition of tannic acid on fermentation par ameters of silage kudzu vine

随着青贮时间的延长，青贮葛藤茎叶中黄曲霉毒素、呕吐毒素以及玉米赤霉烯酮含量均显著降低（P<0.05），单宁酸能显著降低黄曲霉毒素、呕吐毒素以及玉米赤霉烯酮含量。青贮时间和单宁酸添加量对3种毒素的含量具有显著的降低作用（表3）。

在青贮第35天，2.0%TA组青贮葛藤茎叶中黄曲霉毒素含量较对照组降低23.7%，呕吐毒素含量较对照组降低57.3%，玉米赤霉烯酮含量较对照组下降30.0%；青贮第50天，2.0%TA组黄曲霉毒素含量较对照组降低79.3%，呕吐毒素含量较对照组降低54.4%，玉米赤霉烯酮含量较对照组下降23.2%；青贮第70天，2.0%TA组黄曲霉毒素含量较对照组降低47.6%，呕吐毒素含量较对照组下降53.9%，玉米赤霉烯酮含量较对照组降低37.4%（表3）。

表3 添加单宁酸对青贮葛藤霉菌毒素含量的影响Table 3 Effects of tannin acid addition on mycotoxin contents of silage kudzu vine（µg·kg-1）

在青贮葛藤茎叶开封第10天时，对照组p H显著高于第0天；各处理组p H值略有升高，但各处理组间无显著差异（P>0.05）（表4）。在青贮葛藤茎叶开封第10天时，对照组p H较开封第0天升高104.0%，1.0%TA组p H值较开封第0天升高65.6%，1.5%TA组较开封第0天p H值升高52.6%，2.0%TA组p H值较开封第0天升高19.0%。单宁酸处理组乳酸降幅显著低于对照组（P<0.05），2.0%TA组酵母菌数量最低（P<0.05）。因此，2.0%TA组的p H值最低，乳酸降幅较小，酵母菌增加幅度较低，有氧稳定性最佳。有氧暴露时间对添加单宁酸的青贮葛藤茎叶p H（P<0.05）、乳酸含量（P<0.05）及酵母菌数量（P<0.05）具有极显著影响。

表4 添加单宁酸对青贮葛藤有氧暴露过程中p H、乳酸含量和酵母菌数量的影响Table 4 Effects of addition of tannic acid on p H，lactic acid and yeast counts in silage kudzu vine

3 讨论

青贮过程中葛藤茎叶借助微生物的发酵，形成大量的乳酸和挥发性脂肪酸，使pH低于4.2，抑制了所有微生物的活动，从而有效保存青贮饲料的蛋白质等营养物质。本研究发现在葛藤茎叶青贮中添加单宁酸能有效降低可溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和蛋白质的损失，在青贮70 d后，添加2.0%单宁酸的青贮葛藤茎叶中可溶性碳水化合物含量较对照升高15%。前人对黑麦草［8］、苜蓿［12］、葛藤［19］和木薯叶［17］添加单宁酸增加了青贮饲料的DM、CP含量，本研究结果与此相近。单宁酸能迅速降低青贮葛藤茎叶饲料的p H，不仅抑制其他杂菌的繁殖，同时也抑制了葛藤自身的代谢。同时，单宁酸蛋白质结合形成难以水解的络合物，降低蛋白质在瘤胃中的降解率，显著增加青贮饲料过瘤胃蛋白，从而提高反刍动物对饲料蛋白质的利用率［10］，提高动物生产性能和机体体质。这为我国西南山区草食畜牧业发展提供了新的途径。

评价青贮饲料发酵品质的一个重要指标为有机酸，乳酸占有机酸总量比值越大，丁酸占比值越小，青贮饲料品质越好［25-27］。本研究发现葛藤茎叶添加单宁酸青贮后，青贮葛藤乳酸含量显著下降，且没有检测出丙酸和丁酸，与Salawu等［9］、杨冬梅等［19］报道的结果相似。说明添加单宁酸可使青贮葛藤茎叶p H迅速降低，从而进一步抑制各种微生物的生长，有效阻遏了青贮饲料养分的丢失。这可能是单宁酸与蛋白质络合抑制了微生物的繁殖，降低了它们对青贮饲料营养成分的利用，特别是对蛋白质的分解利用。

青贮饲料有氧稳定性一直以来都是国内外学者关注的热点［28］。青贮饲料有氧变质可导致营养物质损失、霉变、毒素蓄积，酵母菌是引起该过程的主要微生物［29-31］。本研究中青贮葛藤茎叶开封后，2.0%TA组的pH值最低，乳酸含量降幅较小，酵母菌数量增加幅度较低，有氧稳定性高。单宁酸能够改善有氧稳定性，主要是抑制酵母菌、霉菌的活性，降低其对青贮葛藤茎叶养分的消耗和有毒物质的形成。此外，单宁酸处理组乳酸含量较高，在一定程度上也抑制了酵母菌和霉菌的生长，延长了青贮饲料在有氧条件下的稳定性。

霉菌毒素可通过饲料进入动物体内，导致动物中毒或者生产性能下降，积聚在动物体内或动物产品（蛋奶等）中，从而降低动物产品品质，甚至引发消费者急性或慢性中毒［32］。霉菌毒素是霉菌等杂菌在被污染的作物上代谢形成的有毒代谢产物［33］。本研究显示单宁酸能显著降低青贮葛藤茎叶中黄曲霉毒素、呕吐毒素以及玉米赤霉烯酮的含量，随着青贮饲料发酵时间的延长，3种毒素的含量也逐渐降低。对照组在有氧发酵阶段，霉菌大量繁殖产生霉菌毒素，当pH进一步下降到乳酸菌成为优势菌群时，霉菌活动受限，霉菌毒素产量逐渐减少。在青贮葛藤中添加单宁酸，不仅使青贮葛藤茎叶p H值下降，而且单宁酸可与霉菌体内的蛋白酶结合，致使胞内蛋白质变性，无法进行正常新陈代谢而死亡，从而达到抑制细菌滋生的效果。湘西地区气候潮湿，干草易于滋生霉菌形成霉菌毒素，不利于葛藤晾制干草。将青绿葛藤茎叶青贮，不仅可充分利用当地丰富的葛藤茎叶资源，同时可解决冬季牛羊牧草不足的问题。

4 结论

在青贮葛藤茎叶中加入适量单宁酸，对青贮葛藤茎叶的品质具有提高作用，可取代甲酸、甲醛等对人及家畜有危害的青贮饲料添加剂，可有效抑制不良微生物活性，提高青贮葛藤茎叶品质，为西南山区草食畜牧业的发展提供新的途径。