微孔多聚糖止血粉成分及体外生物降解分析

杜宝堂，谢冰莹，葛 奇，刘晓勇，杜健宁

（1.江苏奥科生物科技有限公司，江苏镇江 212003；2.苏州大学 医学部药学院，江苏苏州 215123；3.江苏大学 生命科学研究院，江苏镇江 212013）

在不可控出血中，创伤出血和外科手术失血是日常意外事故中经常发生的事故，出血失控也是导致伤员死亡的重要因素[1-2]。为了避免大量失血，因此开发出有效、快速并且安全的止血剂在事故现场以及院前及时有效的止血意义重大[3]。近年来，随着生物医学、材料学、生物工程的快速发展，生物止血材料在促进伤口愈合方面显示出巨大潜力[4]。各种类型的止血粉也不断被开发出来，其类型逐渐由动物源向植物源转化，不可吸收向可吸收转化[5]。其中，微孔多聚糖止血粉是一种自主研发的新型高分子材料，主要是由马铃薯植物淀粉经过变性处理后所制成的微孔多聚糖淀粉颗粒[6]，可通过立即吸收血液中的液体成分以及浓缩血小板和凝血因子来实现，具有良好吸附凝血成分的效果[7]，起到加速内源性凝血过程，从而达到快速的术中止血目的。其作为一种来源于植物淀粉的材料，理论上来说是非常安全的[8]，并且在人体伤口处施用后，最终会被组织以及体液中相应的酶分解，形成单糖等机体正常所需成分，最终被机体所代谢出体外[9]。生物相容性和高效止血材料的开发可以被视为术中和术后快速止血的最佳方法[10]。2004年，Murat等[11]首次描述了植物性淀粉来源的止血剂。目前，可吸收止血剂已经成为外科医疗设备的重要组成部分，用于处理术中出血[12]。鉴于这些止血剂能够有效满足外科手术过程的基本需求，新的止血剂不断开发，其安全性也是最为关注的。

止血粉的商业信息表明，它们在外科手术中被用作控制毛细血管、静脉和小动脉出血的辅助止血剂[13]。成功的止血对于最大限度地减少与一般外科手术有关的围手术期发病率和死亡率至关重要[14]。在外科手术过程中，当无法通过常规方法控制出血时，通常使用外科止血剂作为辅助手段，该方法可以实现快速止血的安全性和有效性，易于使用且能够在大伤口中形成持久止血并且对血源性疾病没有任何风险。Giday等研究证实了止血粉末可以在动物动脉出血中的实现初始止血，而且没有肠梗阻或意外的管腔效应，没有局部或局部颗粒效应，没有全身栓塞效应，也没有全身凝血作用[15]。在临床上，这种多聚糖止血粉在内窥镜鼻窦手术[16，17]、皮肤外科手术[18]和腹腔镜手术中[19]表现了出色的效果。目前国内尚无同类具有自主知识产权的产品面市。因此，本文重点探讨微孔多聚糖止血粉的主要成分以及止血粉生物降解的动态变化规律，以期为临床使用止血粉提供代谢依据。

1 材料与方法

1.1 材料

微孔多聚糖止血粉。

1.2 方法

1.2.1 供试品溶液的制备

止血粉样品在烘箱中50℃烘至恒重后，称量3份，每份称取约5.0mg，分别溶于1mol/L三氟乙酸（TFA）溶液，配成浓度5mg/mL。100℃下降解12h，分别取200μL降解液旋转蒸发去除酸解样品中的TFA，用稀氢氧化钠溶液调pH至中性，加水定容于20mL容量瓶，配成上样浓度50×10-6，0.22µm滤膜过滤备用。

1.2.2 标准品溶液配制

配制100×10-6的葡萄糖和麦芽糖标准溶液及其混合标准溶液；配制7个浓度梯度葡萄糖和麦芽糖二者的混合标准溶液，葡萄糖浓度分别为0.1×10-6、0.5×10-6、1×10-6、2×10-6、4×10-6、8×10-6和10×10-6，麦芽糖浓度分别为1×10-6、5× 10-6、10×10-6、20×10-6、40×10-6、80×10-6、100×10-6；进样量为20μL；采集时间为40min。

1.2.3 止血粉标准曲线

将止血粉配成母液浓度为1mg/mL，沸水溶解，冷却至室温，再将母液倍比稀释成0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.062 5mg/mL和0.031 25mg/mL的溶液，分别取200μL加入至96孔板，然后再分别加入0.1mol/L碘溶液10μL，充分混匀后立即采用全波长酶标仪在610nm处测其吸收度（A值），绘制淀粉标准曲线。

1.2.4 止血粉体外酶解

称取定量止血粉于烘箱中50℃烘至恒重。配制20mmol/L NaH2PO4和6.7mmol/L NaCl溶 液，用1mol/L NaOH/HCl调节pH为6.9，称量止血粉110.8mg，用上述缓冲液配成止血粉浓度为1mg/mL。加入30.7mg CaCl2（~2.5mmol/L），于沸水中溶解5min，冷却至室温。分别取出3份各3mL溶液，作为酶降解0h的样品。剩余溶液中加入3mgα-淀粉酶粉末，混匀。把上述已加α-淀粉酶溶液分装于三个相同的50mL EP管中（3个平行样），每管33mL。放入37℃恒温水浴锅中进行降解，分别作用1h、2h、3h、5h、8h、12h、24h、36h、48h后，每个时间点取3mL样品，100℃煮沸除酶活性。其中1mL样品于12 000r/min离心15min，取上清液，超纯水稀释10倍至止血粉浓度为100×10-6用于离子色谱分析；其余2mL样品灭酶活后不离心直接用于止血粉淀粉含量测定，每个样品分别取3份200μL转移至96孔板，然后分别加入0.1mol/L碘溶液10μL，充分混匀后立即采用全波长酶标仪在610nm处测其吸收度（A值）。

2 结果

2.1 果糖和葡萄糖标准品离子色谱图的确定

如图1所示，酸降解止血粉的标准曲线拟合离子色谱分离条件下，果糖和葡萄糖的保留时间分别为14.9min和10.5min；葡萄糖的标准曲线为y=34.416x-8.551，线性相关系数为0.999 7。

图1 果糖和葡萄糖离子色谱图及葡萄糖标准曲线

2.2 葡萄糖和麦芽糖的离子色谱图确定及标准曲线的建立

如图2所示，在酶降解止血粉的标准曲线拟合离子色谱分离条件下，葡萄糖和麦芽糖的保留时间分别为7.68min和16.06min。葡萄糖的标准曲线为y=42.037x-1.261，线性相关系数为0.9999；麦芽糖的标准曲线为y=19.884x+28.550，线性相关系数为0.9999；止血粉的标准曲线为y=2.442x+0.182，线性相关系数为0.9963。

图2 葡萄糖、麦芽糖及其混合标准品离子色谱图及葡萄糖，麦芽糖和止血粉标准曲线

2.3 止血粉酸降解后单糖谱图分析

止血粉酸降解后的单糖分析谱图见图3，单糖的保留时间在10.5min，说明单糖为葡萄糖。因此采用三氟乙酸降解止血粉得到的单糖皆为葡萄糖，葡萄糖的含量为（54.3±1.5）×10-6，如表1所示。由于葡萄糖分子量为180，淀粉是葡萄糖脱水（分子量18）聚合而成，因此通过葡萄糖含量折算至淀粉含量应乘上系数0.9。淀粉中单糖为葡萄糖的含量为97.8%± 2.6%。

图3 止血粉降解后单糖分析谱图

表1 止血粉酸降解后葡萄糖含量

2.4 止血粉酶解结果分析

止血粉在37℃水中溶解度小，呈混悬液。100℃加热5min后，分成上下两层，上层溶液澄清，下层少量止血粉呈现溶胀状态。此外，若酶解产物的保留时间为7.7min，说明产物为葡萄糖；若酶解产物的保留时间为16.1min，说明产物为麦芽糖；保留时间为14.5min为α-淀粉酶中乳糖；其他保留时间的酶解产物为不同聚合度的寡糖。降解产物中葡萄糖、麦芽糖和乳糖的离子色谱峰面积见表2，降解产物中葡萄糖含量见表3，降解产物中麦芽糖的含量，如表4所示；止血粉α-淀粉酶降解不同时间后产物中未降解淀粉含量，如表5所示。

表2 止血粉不同降解时间离子色谱中葡萄糖、麦芽糖和乳糖峰面积（（nA）×min）

表3 止血粉不同降解时间产物中葡萄糖的含量（x±SD，n=3）

表4 止血粉不同降解时间产物中麦芽糖的含量（x±SD，n=3）

表5 止血粉不同降解时间产物中未降解淀粉的含量（x±SD，n=9）

续表

因此，止血粉在37℃α-淀粉酶作用下，淀粉含量随着降解时间延长逐步减少，从即时的95.6%至48h的8.0%，1h内降解速率最大，约降解了67.3%。降解产物中除有葡萄糖单糖、麦芽糖双糖外，还有寡糖；离子色谱图中乳糖为α-淀粉酶中物质，在降解的48h乳糖含量保持不变。100×10-6止血粉在37℃α-淀粉酶作用下，葡萄糖的含量从即时的0至48h的4.004×10-6，麦芽糖的含量从即时的0ppm至48h的44.692×10-6，1h内麦芽糖生成速率最大，增加了36.509×10-6。

3 结论

本研究是按照《可吸收止血产品注册技术审查指导原则》要求，在体外研究微孔多聚糖止血粉的成分以及生物降解，分别利用酸降解和生物降解法对微孔多聚糖止血粉进行体外降解研究。通过离子色谱法体外测定三氟乙酸降解微孔多聚糖止血粉生成的单糖，从而确定了止血粉的成分。随后采用离子色谱和分光光度法测定该止血粉在37℃、pH=6.9和Ca2+存在条件下，经过α-淀粉酶作用后所产生的葡萄糖，麦芽糖和淀粉含量，进一步确定止血粉的生物降解特性。在酸降解止血粉过程中，由于淀粉是葡萄糖分子聚合而成的，因此淀粉又被分为直链淀粉和支链淀粉两大类型。直链淀粉没有分支的螺旋结构，支链淀粉具有24~30个葡萄糖残基以α-1，4-糖苷键首尾相连而成，在支链处为α-1，6-糖苷键。所以经过酸降解后，能够形成单糖结构。本次所采用三氟乙酸降解止血粉的结果也表明得到的单糖皆为葡萄糖，且葡萄糖的含量为（54.3±1.5）×10-6，且淀粉中单糖为葡萄糖的含量为97.8%±2.6%。

在进行体外酶降解止血粉时，主要选用了血清淀粉酶，也被称之为淀粉内切酶，这是一种α-淀粉酶，在生物体内主要是由胰腺和唾液腺分泌。相关研究表明，α-淀粉酶从人唾液和猪胰腺中得到的α-淀粉酶的最适pH为6.0~7.0。此外，α-淀粉酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既可以作用于直链淀粉，又能够作用于支链淀粉，可以无差别地切断α-1,4-链。其特征主要是能够引起淀粉溶液黏度的急剧下降和碘反应的消失，最终分解直链淀粉时产物以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖；分解支链淀粉时，产物除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1,6-键的α-极限糊精。止血粉在经过48h的体外α-淀粉酶的作用之后，所含淀粉含量逐渐降低，1h之内淀粉降解速率最大为67.3%，生物降解产物中除了含有单糖葡萄糖以外，还含有双糖麦芽糖以及少许寡糖分子。并且麦芽糖含量在1h之内的增加速率最大为81.69%。

对于此类微孔多聚糖止血材料的生物降解性研究也较多，Rong等[4]对一种新型的止血栓塞复合生物材料可降解止血剂凝血酶负载的海藻酸钙微球（TACMs）进行研究，结果表明其可以在体内生物降解并且没有细胞毒性和全身毒性。Shi等[10]对复合微孔多聚糖止血粉的体外研究也表明该类型止血材料具有良好的可降解性以及安全性。Tschan等[7]研究证实微孔多聚糖止血材料在神经外科手术中也是十分安全有效的。并且Singh等[20]的研究表明微孔多聚糖的止血效果比普通明胶基质的止血效果好。因此，认为这些生物来源、无毒、亲水性高、生物相容性和生物降解性良好的微孔多聚糖止血材料可以应用于临床及术中快速止血。而本研究所用到的微孔多聚糖止血粉在体外生物降解后，主要成分是葡萄糖及麦芽糖等，这些成分均是人体所需的能量物质，不会对机体产生毒性，体外代谢结果表明使用微孔多聚糖止血粉1h之内即可被机体所代谢，这也为今后微孔多聚糖止血粉在临床的使用提供了代谢依据。