新加香薷饮挥发油气相色谱指纹图谱研究

鉴志刚，叶世芸*，李向东，王敏（.贵州中医药大学，贵阳 55000；.贵州得轩堂护康药业股份有限公司，贵阳 550008）

新加香薷饮记载于清代医家吴鞠通所著《温病条辩》[1]，由香薷（二钱）、银花（三钱）、鲜扁豆花（三钱）、厚朴（二钱）、连翘（二钱）等5 味中药组成，香薷发汗解表，和中利湿，有“夏月麻黄”之称，为夏月解表祛暑要药，金银花、连翘均味辛凉而质轻清，有轻以去实，清热解毒之功；白扁豆花能健脾化湿以和中，辛凉宣散，增强香薷清透暑热之力；厚朴苦辛性温，燥湿化滞，行气消闷，助香薷理气化湿。诸药相合，共奏祛暑解表，清热化湿之功。临床应用主要集中在夏季暑湿型感冒、发热、中暑等疾病[2-4]，是用于祛湿解表的经典名方，已经收录于国家中医药管理局2018 发布的《古代经典名方目录（第一批）》中。

近几年来，国家连续发布关于经典名方的相关政策，质量控制方面要求更加严格，而指纹图谱是中药质量控制方面常用重要手段[5]，目前新加香薷饮相关报道多集中在其临床应用方面，在质量控制方面仅谢佳佳等[6]建立了新加香薷饮标准汤剂的HPLC指纹图谱，可见相关研究薄弱，同时缺少对方中挥发性成分的相关研究，无法全面地对新加香薷饮进行质量评价，方中多种药材含有挥发性成分，如香薷中麝香草酚、香荆芥酚是2020年版《中国药典》控制香薷质量的指标性成分[7]，故本研究采用GC 法对16 批新加香薷饮的挥发性成分进行指纹图谱研究。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 7890 气相色谱仪及Agilent HP-5 毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm）（美国安捷伦公司）；DZTW 调温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）；电子天平（十万分之一）（杭州友恒称重设备有限公司）。

1.2 试药

对照品麝香草酚（批号：C100179-191125，纯度≥98.00%）、香荆芥酚（批号：C102093-201028，纯度≥99.00%）、α-蒎烯（批号：GZDD0228-201217，纯度≥99.00%）、β-蒎烯（批号：C101512-201109，纯度≥99.00%）（贵州迪大科技有限责任公司）；乙酸乙酯（天津富宇精细化工有限公司，分析纯）。各药材均购自其道地产区或主产区，其来源见表1，均经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为正品。

表1 样品信息Tab 1 Sample information

2 方法与结果

2.1 色谱条件

HP-5 毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm）；FID 检测器；检测器温度240℃；进样口温度240℃；程序升温，以40℃为起始温度，保持2 min，以5℃·min－1升至70℃，以0.5℃·min－1升至74℃，以5℃·min－1升至110℃，以10℃·min－1升至230℃，并保持9.8 min；载气为氮气（＞99.99%）；柱流量为2.0 mL·min－1；分流比为20∶1；进样量为1 μL。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量于5 mL 量瓶中，加乙酸乙酯定容至刻度，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

在Excel 表格中用RAND 函数将各药材不同批次随机排序得到16 个随机组合，编号见表1。照表1组合，按1 钱＝3.73 g，分别称量香薷、厚朴、连翘各7.46 g，金银花及扁豆花各11.19 g，加水浸泡30 min，照2020年版《中国药典》四部通则2204 挥发油测定法甲法操作，于测定器上端加水使之充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，再加乙酸乙酯5 mL，加热回流2 h，分取乙酸乙酯液，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，精密量取续滤液1 mL，即得。

2.4 组方中各药挥发油制备

分别称取组方中各味药材，按“2.3”项下方法制备各单药的挥发油乙酸乙酯溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验 取新加香薷饮供试品溶液、空白溶剂（乙酸乙酯），按“2.1”项下色谱条件分别进样，理论塔板数按麝香草酚计算不少于10 000，各色谱峰分离度良好且拖尾因子在0.95～1.05，表明该方法的专属性良好。

2.5.2 精密度试验 取“2.3”项下同一批次（S16）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，13 号色谱峰峰形及分离度良好，峰面积较大且稳定，故以13 号色谱峰为参比峰，测得各共有峰的相对保留时间的RSD（n＝6）为0.0017%～0.16%，相对峰面积的RSD（n＝6）为0.027%～1.2%，说明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取“2.3”项下同一批次（S16）供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、16、24 h 进样，以13 号色谱峰为参比峰，测得各共有峰相对保留时间的RSD（n＝6）为0.0017%～0.17%，相对峰面积的RSD（n＝6）为0.025%～2.0%，说明该供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批次药材按“2.3”项下方法，制成供试品溶液6 份，按“2.1”项下色谱条件依次进样，以13 号色谱峰为参比峰，测得各共有峰相对保留时间的RSD（n＝6）为0.031%～0.19%，相对峰面积的RSD（n＝6）为0.024%～2.7%，说明该方法重复性良好。

2.6 GC 指纹图谱共有模式的建立与分析

将不同批次的供试品依次进样并记录色谱图，并将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012.130723 版）》，宽度为0.1 min，采用中位数方法，由于溶剂峰太大，影响后续相似度计算结果，且37 min 后无色谱峰，故选取了3～40 min 间色谱图进行色谱峰匹配处理，生成新加香薷饮GC 指纹图谱共有模式，见图1，记录16 批供试品的指纹图谱并生成色谱叠加图，见图2，并对16 批样品图谱进行相似度计算，相似度评价结果见表2。以参比峰的保留时间和峰面积为1，计算各色谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱中参比峰的保留时间和保留峰面积的比值，见表3及表4。

表2 16 批新加香薷饮相似度评价结果Tab 2 Similarity evaluation of 16 batches of Xinjia Xiangru decoction

表3 16 批新加香薷饮GC 指纹图谱共有峰相对保留时间Tab 3 Relative retention time of common peaks in the GC fingerprint of 16 batches of Xinjia Xiangru decoction

表4 16 批新加香薷饮GC 指纹图谱共有峰相对峰面积Tab 4 Relative peak area of common peaks in the GC fingerprint of 16 batches of Xinjia Xiangru decoction

图1 新加香薷饮GC 指纹图谱共有模式Fig 1 Common mode of GC fingerprints of Xinjia Xiangru decoction

图2 16 批次新加香薷饮GC 指纹图谱Fig 2 GC fingerprints of 16 batches of Xinjia Xiangru decoction

结果显示16 批新加香薷饮GC 指纹图谱的共有峰相对保留时间RSD均小于0.18%，说明各共有峰重现性好，各批次间成分差异较小；但共有峰相对峰面积的RSD较大，说明不同批次新加香薷饮各成分含量存在一定差异，产地对各成分含量存在一定影响。通过对相似度评价结果分析发现16 批样品中S14、S4、S10、S1、S2 相似度均低于0.90，说明不同批次新加香薷饮指纹图谱中各共有峰的峰面积存在一定差异。

2.7 GC 指纹图谱中共有峰指认及归属

取“2.2”项下混合对照品及“2.3”项下各单药挥发油乙酸乙酯溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，得到混合对照品溶液的GC 色谱图及新加香薷饮各峰归属图，见图3及图4。通过各图谱对比研究，对指纹图谱中29 个共有峰进行归属分析，其中3、4、5、6、12 号峰来自于连翘，7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19 号归属于香薷，20、21、25、26、27 号来自于扁豆花，22、23、24、28、29 号来自于厚朴，共有峰中未发现来自于金银花的特有峰成分。通过比对指认出4 个色谱峰，其中5 号为α-蒎烯、6 号为β-蒎烯、13 号为麝香草酚、14 号为香荆芥酚。

图3 混合对照品色谱图Fig 3 Chromatogram of mixed reference substance

图4 新加香薷饮各峰归属Fig 4 Assignment of the peaks of Xinjia Xiangru decoction

3 讨论

3.1 供试品溶液制备条件的选择

通过查阅《中国药典》2020年版及多篇文献[8-12]，本研究以色谱图中总峰面积、峰形、分离度等为参考指标，分别对供试品溶液提取中提取方式、萃取溶剂、提取时间进行了考察与优化，提取方式上分别考察了水蒸气蒸馏法、超声法、挥发油提取法，结果表明挥发油提取法所提取的供试品总峰面积大，峰数目多，提取效率高；提取时间上先后考察了2、4、6、8 h，发现提取4 h 较提取2 h 效果更好，但与6 h、8 h 相比差异较小，为提高效率及节约资源，故选择提取4 h；萃取溶剂考察了乙酸乙酯、乙醚、石油醚（60～90 ℃）、正丁醇等不同溶剂，结果发现相较于其他溶剂，乙酸乙酯能完全溶解新加香薷饮中挥发性成分，对样品无干扰，且沸点高，毒性低，更不容易挥发，制得供试品溶液更易于保存，故采用乙酸乙酯作为其萃取溶剂。

3.2 指纹图谱色谱条件的考察

本研究考察了HP-1（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、HP-5（30 m×0.32 mm，0.5 μm）、DB-1（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、DB-1701（30 m×0.25 mm，0.25 μm）等多种色谱柱，最终发现HP-5（30 m×0.32 mm，0.5 μm）可以满足出峰要求，各色谱峰分离度较好，拖尾因子介于0.95～1.05，因此选用此规格毛细管柱建立新加香薷饮GC 指纹图谱。

3.3 GC 指纹图谱建立的意义

本研究建立了新加香薷饮的GC 指纹图谱，并对16 批样品进行了相似度评价，结果显示16批样品成分含量存在一定差异，所建立的GC 指纹图谱测定方法可为新加香薷饮中挥发性成分的整体评价提供依据。

本研究所指认出的麝香草酚、香荆芥酚、α-蒎烯、β-蒎烯均有一定的抗菌及抗病毒[13-14]功效，以上成分可能是新加香薷饮治疗流感疾病的药效物质基础[15]，但配伍后其相互作用机制需进一步研究。通过对16 批样品共有峰分析发现不同产地来源所组成的新加香薷饮挥发性成分存在一定差异，不同产地对其含量及疗效的影响有待进一步探索。