探讨葛根素基于p38丝裂原活化蛋白激酶通路对慢性牙周炎小鼠症状的改善作用及对牙周组织生长的影响

王锦锋， 秦红霞

（郑州大学第一附属医院口腔预防科，河南 郑州 450000）

牙周病是口腔疾病中最常见的一种，主要包括牙龈炎和牙周炎两大类。牙龈炎指病变部位在局部牙龈的上皮及结缔组织内，未引起其他部位病变的一类疾病。当牙龈炎没有得到及时的治疗，炎症蔓延至结缔组织深层，造成牙周纤维结缔组织降解，牙槽骨不同程度的吸收和牙齿病理性移位甚至脱落等症状，即为牙周炎。牙周炎的发生严重降低患者的生活质量，也是目前我国成年人失牙的主要原因[1]。

目前，针对牙周炎的治疗措施主要包括牙周基础治疗、新技术辅助治疗和药物治疗三个方面。基础治疗和新技术辅助治疗通常只能达到清洁刮治牙周表面的作用，无法完全清除病原微生物入侵牙周组织引起的感染和炎症，需要药物治疗进行补充。治疗牙周炎的药物主要包括口腔局部药物和全身药物。局部用药以抗菌为主，配合超声洁治和刮治，通过较深层部位的局部和持续给药，提高基础治疗的作用[2]。

中医学以辩证理论为基础对牙周炎进行治疗，内外兼顾不仅能够抗菌消炎，还能提高自身免疫力，受到学者们的重视[3]。葛根素（Puerarin，C21H20O9）是豆科植物野葛[（Pueraria lobata(Willd.)Ohwi）]的干燥根中最主要的活性成分之一，属于异黄酮类。近年来研究发现，葛根素同时具有抗炎、骨保护等活性且具有较高的生物安全性。本课题采用正畸钢丝结扎和牙龈卟啉菌感染的方法建立慢性牙周炎小鼠模型，通过观察实验小鼠牙周组织的生长情况及外周血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症指标浓度的变化，研究葛根素对慢性牙周炎小鼠的治疗作用。并进一步通过蛋白质印迹（Western Blot）实验来探究葛根素治疗慢性牙周炎的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

12周龄的健康C57BL/6J雄性小鼠共40只，体质量为22～25 g，由上海实验动物中心提供[动物许可证号:SCXK（沪）2019-0009]。购入小鼠后，在饲养室内适应环境1周，自由进水、进食。饲养室内空气流通、环境整洁，室温22～24℃，相对湿度约为50%，每日光照及黑暗时间各12 h。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 葛根素（批号110752-201814）购自美国Sigma公司；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号1800308）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司；注射用0.9%氯化钠溶液（批号1802260703）和水合氯醛（分析纯，批号20190126）均购自国药集团；牙龈卟啉菌液由吉林大学基础医学院病原生物学系鉴定和提供；缓冲液、十二烷基磺酸钠 （sodium dodecyl sulfate，SDS）、30%聚丙烯酰胺、Tris（pH 8.8与pH 6.8）、10×电泳液、50×TAE、ECL发光显影液均购自中国碧云天生物技术有限公司；TNF-α、IL-1β和IL-6酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自美国R＆D Systems公司；p38MAPK和P-p38MAPK抗体（一抗）来自美国Abcam生物科技公司；标记辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的甘油醛-3-磷酸脱氢 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehyolrogenase，GAPDH）抗体来自美国Sigma生物科技公司；脂多糖（lipopdysaccharide，LPS）和蛋白提取试剂盒购自索莱宝生物科技有限公司。

1.2.2 主要仪器设备 牙龈分离器、牙周探针等手术器械（杭州奥索医疗器械有限公司，中国）；直径0.2 mm的正畸结扎钢丝（杭州奥索医疗器械有限公司，中国）；Read Max1900型全波长酶标仪（Bio Tek公司，加拿大）；DYY-1C型凝胶成像系统（北京六一仪器厂，中国）；TE77XP型半干转膜仪系统（Hoefer公司，美国）；PowerPack HV型电泳仪（Bio-Rad公司，美国）；荧光显微镜（Nikon公司，日本）；KZ-III-F型低温高速组织研磨器（武汉塞维尔生物科技有限公司，中国）；低温型高速离心机（Beckman公司，美国）。

1.3 方法

1.3.1 动物建模与分组 实验小鼠适应环境1周后进行随机分组，每组8只，共分为对照组、模型组、葛根素低剂量组、葛根素中剂量组、葛根素高剂量组。建立慢性牙周炎小鼠模型：除对照组外，用新鲜配置的已过滤的10%水合氯醛溶液按照0.01 mL/g的剂量对其余各组小鼠进行腹腔注射的全身麻醉。麻醉成功后，将小鼠置于超净工作台中固定，用牙龈分离器剥离小鼠左侧上颌第一磨牙处的牙龈组织，使局部牙龈受到刺激产生炎性水肿，以便进行结扎操作。剥离操作每天1次，连续进行2 d。从建模第3天起，用0.2 mm正畸结扎钢丝将小鼠右侧上颌第一、第二磨牙的牙颈部进行牢固结扎，截断多余扎丝，将钢丝末端尽量向牙根方向靠近并压入龈沟内部，每天检查结扎的情况，确保扎丝长期牢固，避免出现松动。分别在建模第3、5、7和9天时，将2μL牙龈卟啉菌液和15μL 1 mg/mL的LPS 0.9%氯化钠溶液均匀注射到小鼠的牙周。建模3周后进行灌胃给药。将葛根素混悬于0.5%的CMC-Na溶液中进行灌胃给药，葛根素低、中、高剂量组小鼠的灌胃剂量分别为150、300、600 mg/kg，灌胃容积为0.03 mL/g。对照组和模型组小鼠灌胃给药等量0.5%的CMC-Na溶液，给药溶液现用现配，每天1次，共治疗2周。

1.3.2 ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度 每组小鼠用10%的水合氯醛麻醉后进行眼底取血，血样静置于离心管中，禁止振荡，4℃离心5 min，离心半径为7.5 cm，转速3 000 r/min，取上清液用于后续试验检测。取出冰箱中的ELISA试剂盒恢复至室温后，按照酶联免疫试剂盒操作说明书制定标准曲线，然后测定血清样品在450 nm处的吸光度值，并根据标准曲线分别计算血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度。

1.3.3 Western Blot检测相关蛋白的表达 各实验组小鼠取血清后用脊椎脱臼法进行处死，置于超净工作台上固定后，用75%的乙醇擦拭唇周及口腔，分离上颌骨，用已灭菌的解剖剪取左侧上颌骨第一、第二磨牙周围龈缘以下2 mm的牙龈及牙周组织，在磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）中清洗2遍，并剪成细小的碎片。将每组小鼠的组织碎片均匀混合一起，于-4℃的条件下用组织研磨器进行研磨，用组织蛋白抽提试剂盒进行蛋白提取。采用蛋白质定量（bicin choninic acid，BCA）法测定各组样品的蛋白浓度，计算并制备含等量蛋白的样品。每组样品按蛋白量的5∶1加入上样缓冲液（loading buffer）并煮沸定性，置于-20℃冰箱保存备用。

制作十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电脉（sodium dodecyl sulfate ployacryl mide gel electropho resis，SDS-PAGE）凝胶进行电泳分离蛋白质，然后用半干转膜仪进行转膜。在5%的脱脂奶粉中封闭1 h，用PBS在摇床上洗膜3次，每次10 min。用一抗进行封闭，一抗的浓度分别为p38MAPK（1∶1 000）、P-p38MAPK（1∶1 000），4℃下进行孵育过夜。次日用PBST（磷酸盐缓冲液）在摇床上洗膜3次，每次10 min。加入与一抗种属对应的HRP标记的二抗，在低速摇床上室温孵育1 h。用PBST洗膜3次，方法同上。使用ECL化学发光液显色发光，凝胶成像系统拍照，用Image Pro Plus图像分析系统对蛋白条带进行分析，以GAPDH作为内参，用化学发光法检测，Quantity One软件进行图像分析。

1.4 统计学分析

采用Graphpad Prism 7.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠临床表现及牙周组织生长情况

对照组小鼠牙龈表面呈现淡粉色，质地坚韧、富有弹性，探诊时无出血现象。模型组小鼠出现牙周炎症状，牙龈有明显红肿、肥大，牙龈组织松软，甚至出现溃疡现象，探诊出血明显，并伴有自发出血倾向。葛根素低剂量组小鼠的牙龈有中度的炎性症状，出现发红、光亮和肿胀现象，牙周探诊有轻微出血。与模型组比较，葛根素中、高剂量组小鼠牙周炎症状明显改善，牙龈颜色和形态有轻微不明显变化，牙周探诊无出血现象。

2.2 各组大鼠外周血清中TNF-α、IL-1β和IL-6浓度测定

与对照组比较，模型组小鼠外周血清中TNFα、IL-1β和IL-6浓度显著高（P<0.01）。与模型组比较，葛根素低、中、高剂量组小鼠体内血清中TNFα、IL-1β和IL-6的浓度显著降低（P<0.05），见图1。

图1 各组小鼠外周血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平比较Figure 1 The peripheral serum levels of TNF-α,IL-1β,and IL-6 in mice in each experimental group

2.3 Western Blot检测相关蛋白的表达

与对照组比较，模型组小鼠牙周组织中p38MAPK和P-p38MAPK蛋白表达显著升高（P＜0.001）。与模型组比较，葛根素低、中、高剂量组小鼠牙周组织中P-p38MAPK蛋白的表达量显著降低（P＜0.01）；葛根素低、中、高剂量组小鼠牙周组织中p38MAPK蛋白的表达量降低（P＜0.05），见图2。

图2 各组小鼠牙龈及牙周组织中P-p38MAPK和p38MAPK蛋白的表达Figure 2 Effect of Puerarin on the expression of the Pp38MAPK and p38MAPK protein in mice periodontal tissue

3 讨论

慢性牙周炎发生发展的主要致病因素为局部刺激和细菌感染。本实验采用结扎法结合细菌感染建立慢性牙周炎小鼠模型。首先，在进行结扎之前牙龈剥离是为了模拟牙龈的局部刺激，造成牙周软组织的急性水肿，便于进行结扎操作。其次，结扎材料选择正畸结扎钢丝取代常规的线结扎法，能够保证结扎的牢固性。钢丝末端深入龈沟内部，容易造成食物嵌塞，为后期牙周炎发生、发展创造了必要基础条件。除此之外，牙菌斑生物膜细菌及其产物是慢性牙周炎的始动因子，与慢性牙周炎关系密切[4]。牙龈卟啉菌属于革兰阴性厌氧菌，也是目前研究最广且证据充分的重要的牙周致病菌之一[5]。LPS是革兰阴性菌外膜中的主要结构成分，具有广泛的生物活性，也是引起牙周炎重要的毒力作用因子之一[6]。因此，本实验在建模的第3、5、7和9天进行牙周注射牙龈卟啉菌液和LPS 0.9%氯化钠溶液，能够将牙周致病菌定植在宿主的适当部位，抑制或逃避了宿主的防御功能，从而引起牙齿支持组织的慢性炎症及破坏[7]。

慢性牙周炎与全身系统性疾病具有密切联系，由于慢性牙周炎患者的牙周组织处于慢性炎症的持续感染状态，造成血清中炎症指标也随之上升[8]。TNF-α是活化的单核巨噬细胞产生的具有多种生物学活性的糖蛋白及多功能的炎性因子，具有多种免疫调节功能。研究[9-12]表明，TNF-α能够激活前破骨细胞成熟为破骨细胞，减少骨基质钙化，最终引起牙槽骨吸收，与牙周炎发生和牙周炎的破坏程度密切相关。另外，牙周致病菌还可以通过其他途径分泌IL-6和TNF-α[13]。细胞因子IL-6和TNF-α能够发挥协同作用，共同参与牙槽骨的吸收和破坏。细胞因子IL-1β作为机体免疫功能的重要判断指标，不仅在基础免疫研究方面具有重要的作用，在探索疾病发病机制和疗效判断等方面也具有重要的应用价值[14]。本研究中选取实验小鼠血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6作为检测指标，结果显示以上炎症指标均显著升高，表示慢性牙周炎小鼠建模成功。

p38MAPK是MAPK家族控制炎症反应最重要的成员之一，在细胞内参与细胞分化、炎症反应、细胞凋亡和器官发育等许多方面[15]。当受到细菌、脂多糖、渗透性应激和生理性应激时，p38MAPK能够被激活而发生核转位，即从细胞质进入细胞核，进而对许多转录因子和蛋白激酶进行磷酸化，从而发挥激活的作用[16]。激活的p38MAPK即P-p38MAPK，其活性增强，能够激动激活转录因子1和2、肌细胞增强因子，促进细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，促进和增强炎症反应[17]。Western Blot研究结果显示：与对照组比较，模型组小鼠牙周组织细胞中p38MAPK和P-p38MAPK蛋白表达显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，葛根素低、中、高剂量组小鼠牙周组织细胞中的p38MAPK和P-p38MAPK蛋白表达显著降低（P＜0.01）。该结果表明，葛根素经灌胃后能够通过抑制p38MAPK的磷酸化，从而使其活性降低，进而减少促炎因子分泌，降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，减轻炎症反应，缓解小鼠的牙周炎症状。

综上所述，葛根素能显著减轻慢性牙周炎小鼠的炎症反应，改善牙周炎症状，而且其可能通过p38MAPK信号通路发挥治疗作用。