仙鹤草中木脂素类化学成分的研究

张 佳，杨桠楠，姜建双，冯子明，苑 祥，张 旭，张培成

•化学成分 •

仙鹤草中木脂素类化学成分的研究

张 佳，杨桠楠，姜建双，冯子明，苑 祥，张 旭，张培成*

中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050

对仙鹤草的化学成分进行分离和鉴定，并利用去血清损伤的PC12细胞模型筛选化合物的神经保护活性。利用80%乙醇对仙鹤草进行提取，再通过大孔吸附树脂、ODS、硅胶、Sephadex LH-20凝胶以及半制备型高效液相等柱色谱方法进行分离，然后根据质谱、核磁、圆二色谱等波谱学数据鉴定化合物的结构。从仙鹤草中分离并鉴定了10个木脂素类化合物，分别命名为仙鹤草酸酯（1）、仙鹤草苷A（2）、苦树苷C（3）、长花马先蒿苷B（4）、(7,8)-4,7,9,9′-四羟基-3,3′-二甲氧基-8--4′-新木脂素-7--β--葡萄糖苷（5）、(7,8)-3-甲氧基-8,4′-氧代新木脂素-3′,4,7,9,9′-五醇（6）、红叶藤苷（7）、(7,8)-1-[4--(β--吡喃葡糖糖基)-3-甲氧基苯基]-2-[4-(3-羟丙基)-2,6-二甲氧基苯氧基]-1,3-丙二醇（8）、密穗马先蒿苷（9）、淫羊藿醇A2（10）。化合物1和2为新化合物，其余化合物均为首次从仙鹤草中分离得到。化合物1a和1b为1对互变的葡萄糖端基手性相反的8--4′型木脂素酸酯；化合物1在10 μmol/L对去血清损伤的PC12神经细胞表现出一定的保护作用。

仙鹤草；8--4′型木脂素；结构互变；仙鹤草酸酯；仙鹤草苷A；神经保护；PC12神经细胞

仙鹤草Ledeb. 又名龙芽草、脱力草、狼牙草，为蔷薇科多年生草本植物，广泛分布于我国南北各省[1]。仙鹤草始载于《滇南本草》，性苦、涩，味平，归心、肝经，以全草入药，具有收敛止血、截疟、止痢、解毒、补虚等功效[2]。现代药理学研究表明，仙鹤草具有降糖、抗炎、抗肿瘤以及止血等作用[3-6]。同时，化学研究显示仙鹤草具有黄酮、间苯三酚、异香豆素、三萜等多种类型的化学成分[5,7-9]。前期，本课题组从仙鹤草中发现了一系列间苯三酚衍生物[10]，为了进一步阐明仙鹤草的物质基础，寻找具有生物活性的小分子化合物，本实验继续对仙鹤草乙醇提取物中的化学成分进行研究，采取多种色谱手段分离到了10个木脂素类化合物，分别鉴定为仙鹤草酸酯（pilosaneolignan ester，1）、仙鹤草苷A（pilosaneolignanside A，2）、苦树苷C（picraquassioside C，3）、长花马先蒿苷B （longifloroside B，4）、(7,8)-4,7,9,9′-四羟基-3,3′-二甲氧基-8--4′-新木脂素-7--β--葡萄糖苷[(7,8)-4,7,9,9′-tetrahydroxy-3,3′-dimethoxy-8,4′- oxyneolignan-7--β--glucoside，5]、(7,8)-3-甲氧基-8,4′-氧代新木脂素-3′,4,7,9,9′-五醇[(7,8)-3- methoxy-8,4′-oxyneoligna-3′,4,7,9,9′-pentol，6]、红叶藤苷（rourinoside，7）、(7,8)-1-[4--(β--吡喃葡糖糖基)-3-甲氧基苯基]-2-[4-(3-羟丙基)-2,6-二甲氧基苯氧基]-1,3-丙二醇（(7,8)-1-[4--(β-- glucopyranosyl)-3-methoxyphenyl]-2-[4-(3-hydroxy- propyl)-2,6-imethoxyphenoxy]-1,3-propanediol，8）、密穗马先蒿苷（densispicoside，9）、淫羊藿A2（icariol A2，10），结构见图1。其中，化合物1和2为新化合物，其余化合物均为首次从仙鹤草中分离得到。值得注意的是，化合物1a和1b为1对互变的糖端基手性相反的8--4′型木脂素葡萄糖酸酯；化合物1在10 μmol/L浓度下对去血清损伤的PC12神经细胞表现出一定的保护作用。

1 仪器与材料

布鲁克AVANCE III-500型核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；P-2000型旋光仪、Jasco J-815型圆二色谱仪、Jasco V-650型紫外光谱仪（日本Jasco公司）；Nicolet 5700傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Electron公司）；Agilent 6520 seriesQ-TOF LC/MS型高分辨质谱仪（美国Agilent公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；岛津LC-6AR制备型高效液相色谱仪，配备SPD-20A型检测器（日本岛津公司）；YMC-Pack ODS-A半制备型高效液相色谱柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司）；Agilent 7890A型气相色谱仪（美国Agilent公司）；HP-5毛细管柱（30 m×0.32 mm，迪马科技）；EYELA FDU-1110型冷冻干燥机（日本东京理化株式会社）；柱色谱硅胶（200～300目，青岛海洋化工厂）；HP-20型大孔吸附树脂（日本三菱公司）；Sephadex LH-20型凝胶（瑞士Pharmacia公司）；ODS填料（30～50 μm，日本YMC公司）。

图1 化合物1～10的结构

仙鹤草于2018年11月购自安徽亳州，经中国医学科学院北京协和医学院药物研究所马林副研究员鉴定为蔷薇科龙牙草属植物仙鹤草Ledeb. 的全草，标本（ID-S-2981）现存放于中国医学科学院北京协和医学院药物研究所标本室。

2 提取与分离

取100 kg干燥的仙鹤草，粉碎，用80%乙醇水浸泡过夜，80 ℃回流提取3次（750、600、600 L），分别提取1.5、1.5、1 h。合并提取液经减压浓缩，得粗提物11 kg。用30 L蒸馏水分散总浸膏，依次用50 L的石油醚、醋酸乙酯和正丁醇系统萃取，各萃取3～5次，减压浓缩，分别得石油醚萃取部位100 g、醋酸乙酯萃取部位470 g、正丁醇萃取部位2.0 kg和残留水溶性部位4.7 kg。

取正丁醇部位2.0 kg，用水溶解，经HP-20大孔吸附树脂柱色谱进行梯度洗脱，洗脱体系为乙醇和水，梯度依次为纯水和15%、30%、50%、95%乙醇。选择30%乙醇洗脱部位经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，乙醇-水（0∶100～100∶0）梯度洗脱，经HPLC分析，得到6个亚流分（Fra. A～F）。取Fra. A（9.0 g）经ODS中压柱色谱分离，甲醇-水（2∶98～100∶0）洗脱。合并流分Fra. A-32～33，经Sephadex LH-20柱色谱和半制备型高效液相纯化得化合物3（10.4 mg）和8（6.5 mg）。取Fra. B（10.0 g）经ODS中压柱色谱分离，甲醇-水（2∶98～100∶0）洗脱，合并流分Fra. B-27～29，经2次半制备型高效液相纯化得化合物4（4.3 mg）和5（9.5 mg）。流分Fra. B-47经Sephadex LH-20 柱色谱（甲醇）分离，流分Fra. B-47-7～10合并，通过半制备液相进行纯化得化合物7（12.4 mg）。取Fra. D（10.33 g）经ODS中压柱色谱分离，甲醇-水（2∶98～100∶0）洗脱。流分Fra. D-20通过Sephadex LH-20（甲醇）和半制备型高效液相色谱纯化得化合物2（10.3 mg）。合并流分Fra. D-21～26，经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇）分离，再次经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇）和半制备液相纯化，得化合物1（7.2 mg）。合并Fra. D-32～37，经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇）和半制备液相色谱反复纯化，得化合物6（4.0 mg）、9（8.1 mg）和10（14.4 mg）。

3 结构鉴定

化合物1由1对互变体1a和1b组成，由于不能稳定地单独存在，因此混合测试核磁信号。1H-NMR谱（表1）显示有2对反式双键的氢信号H7.57 (2H, d,= 16.0 Hz, H-7′), 6.33 (2H, dd,= 1.7, 16.0 Hz, H-8′)；2组ABX自旋偶合系统的氢信号H7.01 (2H, d,= 1.7 Hz, H-2), 6.74 (2H, d,= 8.1 Hz, H-5) 和6.84 (2H, dd,=1.7, 8.1 Hz, H-6)；6个芳香氢信号H7.07 (2H, brs, H-2′), 6.98 (2H, overlapped, H-5′), 6.97 (2H, overlapped, H-6′)；2个葡萄糖端基氢信号H4.51 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1′′1a) 和5.11 (1H, d,= 3.6 Hz, H-1′′1b)；2个甲氧基氢信号H3.80 (6H, s, -OCH3)。13C-NMR谱（表1）共显示有34个碳信号，结合HSQC谱分析可知1a和1b的结构属于8--4′型木脂素糖苷，碳信号分别归属为2个羰基碳信号C169.1和169.0；4个烯碳信号C146.7, 146.6, 116.6, 116.6；2组芳香碳信号150.5, 149.4, 149.1, 147.4, 134.1, 130.2, 122.3, 120.7, 117.5, 116.1, 115.9, 111.5，其中包括4个与氧原子直接相连的碳信号C150.5, 149.4, 149.1, 147.4；2个甲氧基碳信号C56.4；2组葡萄糖基碳信号C98.4, 94.2, 78.1, 76.3, 75.6, 74.9, 73.9, 72.2, 71.9, 70.9, 65.1, 65.0。

在HMBC谱（图2）中，H-6与C-2 (C111.5), C-4 (C147.4), C-5 (C116.1)；H-2′与C-3′ (C149.4), C-4′ (C150.5), C-6′ (C122.3) 的相关信号确证2个苯环（A和B环）的存在，-OCH3和C-3的HMBC相关信号提示甲氧基取代在C-3位。另外，H-7与C-1 (C134.1), C-2 (C111.5), C-6 (C120.7)；H-8与C-1 (C134.1), C-4′ (C150.5)；以及H2-9与C-7 (C74.0), C-8 (C86.4) 的相关信号进一步确证了8--4′型木脂素的结构片段。而H-7′与C-1′ (C130.2), C-2′ (C115.9), C-6′ (C122.3), C-9′ (C116.6)；H-8′与C-1′ (C130.2), C-7′ (C146.7), C-9′ (C169.1) 的HMBC远程相关提示在B环存在1个苯丙烯酸的片段。分析2个糖基信号，发现端基碳 (C-1′′) 化学位移值 (C98.4和94.2) 较正常值偏小，C-6′′ (C65.1和65.0) 化学位移值较正常值偏大[11]，由此推测糖基和木脂素是通过6′′位的羟基和9′位的苯丙烯酸形成了酯键，而H2-6′′与C-9′ (C169.1) 的HMBC相关信号则正好验证了这点。由于葡萄糖基C-1′′半缩醛的结构不稳定，因此C-1′′存在α（1a）和β（1b）2种构型，能够自发地互相转变。而1a和1b的C-7′ (C146.67和146.62)、C-8′ (C116.63和116.57) 和C-9′ (C169.06和168.96) 的化学位移由于糖基影响也出现较小的差别（表1）。

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据(500/125 MHz, CD3OD)

图2 化合物1和2主要的HMBC、1H-1H COSY和ROESY相关

由于化合物1的C-9位亚甲基氢化学位移差值（∆H-9a–H-9b）为0.22，根据文献报道[12]判断化合物1的C-7位和C-8位的相对构型应为苏式 ()。化合物1的实验圆二色谱（ECD）谱图显示在251.5 nm处有1个正的Cotton效应，提示其8位碳的绝对构型为[13]。因此，化合物1的结构鉴定为(7,8,7′)-4,7,9,3′,9′-pentahydroxy-3-methoxy-8,4′- oxyneolign-7′-ene-(9′→6′′)--glucopyranose ester。经检索，该化合物为1个新的木脂素葡萄糖酸酯，并命名为仙鹤草酸酯。

1H-NMR谱（表2）显示有1个典型的ABX偶合系统H7.02 (1H, brs, H-2), 6.89 (1H, brd,= 8.1 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5)；1个AX偶合系统H6.86 (1H, brs, H-2′), 6.67 (1H, brs, H-6′)；1对反式双键氢信号H6.47 (1H, d,= 15.8 Hz, H-7′), 6.26 (1H, dt,= 5.6, 15.8 Hz, H-8′)；1个甲氧基氢信号H3.86 (3H, s, -OCH3)；2个与氧原子直接相连的亚甲基氢信号H4.20 (2H, d,= 5.6 Hz, H2-9′), 3.66 (1H, dd,= 3.0, 12.3 Hz, H-9a) 和3.29 (1H, overlapped, H-9b)；2个与氧原子直接相连的次甲基氢信号H4.98 (1H, d,= 8.6 Hz, H-7), 4.05 (1H, m, H-8)；1个β型葡萄糖端基氢信号H4.95 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′′)，结合位于低场的一系列氢信号H3.40～3.95说明含有1个葡萄糖基。13C-NMR谱（表2）显示有25个碳信号，结合HSQC谱可知含有2个苯环C152.6, 152.5, 149.2, 147.7, 137.0, 135.2, 133.6, 131.4, 129.9, 121.3, 116.2, 111.8, 110.2, 107.7，1对双键碳信号C131.4和129.9，2个与氧原子直接相连的次甲基碳信号C89.9和75.1，2个与氧原子直接相连的亚甲基碳信号C63.8和61.5，以及1个甲氧基碳信号C56.6。

表2 化合物2的1H-NMR和13C-NMR 数据 (600/150 MHz, CD3OD)

对比已知化合物(−)-(7,8,7′)-4,7,9,3′,9′- pentahydroxy-3,5′-dimethoxy-8-4′-oxyneolign-7′-ene-3′--β--glucoside[14]的核磁数据可知它们的结构非常相似，都属于8--4′型木脂素，区别仅在于C-5′位的甲氧基。在二维核磁谱中（图2），H-7与C-1 (C133.6), C-2 (C111.8), C-6 (C121.3)；H-7′与C-1′ (C135.2), C-2′ (C110.2), C-6′ (C107.7), C-9′ (C63.8)；H-8′与C-1′ (C135.2), C-7′ (C131.4), C-9′ (C63.8) 的HMBC相关信号，结合H-7-H-8-H2-9和H-7′-H-8′-H2-9′的1H-1H COSY相关信号分别证明了2个苯丙素的结构片段的存在。另外，H-8与C-4′ (C137.0) 的HMBC相关信号则确证了8--4′型木脂素的骨架类型，-OCH3与C-3 (C149.2) 的HMBC相关信号说明C-3位被1个甲氧基所取代，H-1′′与C-3′的HMBC相关信号，结合H-3′和H-1′′的ROESY相关信号说明糖基取代在C-3′位羟基上。由文献报道[15]可知，C-7 (C75.1) 和C-8 (C89.9) 的化学位移说明相对构型为苏式（）。利用蜗牛酶水解化合物2，得到苷元2a和葡萄糖。对葡萄糖进行衍生化[10]，并通过气相色谱仪分析（进样口温度为300 ℃，氮气体积流量1.0 mL/min，起始温度为200 ℃，10 ℃/min升至280 ℃，保持35 min，检测器温度为300 ℃），结果验证了-葡萄糖基的存在。苷元2a不溶于氯仿，对比2和2a的实验ECD谱图（图3），在220和250 nm左右具有负的Cotton效应，提示8位碳的绝对构型为[13]。因此，化合物2的结构鉴定为(7,8,7′)-4,7,9,3′,9′-pentahydroxy- 3-methoxy-8,4′-oxyneolign-7′-ene-3′--β--gluco- pyranoside。经检索，该化合物为1个新的木脂素葡萄糖苷，命名为仙鹤草苷A。

图3 化合物2和2a的实验ECD谱图

化合物3：白色无定形粉末，1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 6.74 (2H, s, H-2, 6), 6.73 (2H, s, H-2′, 6′), 6.55 (1H, dd,= 4.8, 15.8 Hz, H-7′), 6.32 (1H, dt,= 5.6, 15.8 Hz, H-8′), 4.93 (1H, overlapped, H-7), 4.81 (1H, d,= 7.5 Hz, H-1′′), 4.27 (1H, m, H-8), 4.23 (2H, dd,= 1.4, 5.6 Hz, H2-9′), 3.91 (1H, dd,= 5.1, 12.1 Hz, H-6′′a), 3.83 (6H, s, 3, 5-OCH3), 3.40～3.85 (7H, overlapped, H2-9, 2′′～6′′b), 3.81 (6H, s, 3′, 5′-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 139.7 (C-1), 106.0 (C-2, 6), 154.0 (C-3, 5), 135.5 (C-4), 74.1 (C-7), 87.2 (C-8), 61.7 (C-9), 134.9 (C-1′), 154.6 (C-2′, 6′), 104.9 (C-3′, 5′), 136.4 (C-4′), 130.0 (C-7′), 131.5 (C-8′), 62.7 (C-9′), 105.7 (C-1′′), 75.8 (C-2′′), 78.5 (C-3′′), 71.4 (C-4′′), 77.9 (C-5′′), 63.7 (C-6′′), 57.1 (3, 5-OCH3), 56.8 (3′, 5′-OCH3)。以上数据和文献报道一致[16]，根据C-7 (C74.1) 和C-8 (C87.2)的化学位移可知相对构型为苏式（）[15]，结合ECD谱图在237 nm处有1个负的Cotton效应，提示绝对构型为7,8，故鉴定化合物3为苦树苷C。

化合物4：白色无定形粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7.12 (1H, m, H-2′), 7.08 (1H, m, H-5′), 6.91 (1H, m, H-6′), 6.73 (2H, s, H-2, 6), 6.54 (1H, d,= 15.8 Hz, H-7′), 6.32 (1H, dt,= 5.1, 15.8 Hz, H-8′), 4.95 (1H, d,= 5.2 Hz, H-7), 4.86 (1H, overlapped, H-1′′), 4.22 (3H, overlapped, H-8, H2-9′), 3.89 (1H, m, H-9a), 3.87 (1H, overlapped, H-6′′a), 3.85 (3H, s, 3-OCH3), 3.82 (6H, s, 3′, 5′-OCH3), 3.68 (1H, d,= 11.9 Hz, H-6′′b), 3.56 (1H, dd,= 3.0, 12.0 Hz, H-9b), 3.36～3.50 (4H, overlapped, H-2′′～5′′)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 134.9 (C-1), 104.9 (C-2, 6), 154.7 (C-3), 137.6 (C-4), 154.7 (C-5), 73.9 (C-7), 87.4 (C-8), 61.6 (C-9), 136.4 (C-1′), 112.4 (C-2′), 150.6 (C-3′), 147.3 (C-4′), 117.7 (C-5′), 120.9 (C-6′), 131.5 (C-7′), 130.0 (C-8′), 63.7 (C-9′), 103.1 (C-1′′), 75.0 (C-2′′), 77.9 (C-3′′), 71.5 (C-4′′), 78.3 (C-5′′), 62.6 (C-6′′), 56.8 (3, 3′, 5′-OCH3)。以上数据和文献报道一致[17]，根据C-7 (C73.9) 和C-8 (C87.2) 的化学位移，以及H2-9的化学位移差值（∆H-9a–H-9b＝0.33）可知相对构型为苏式（）[12]，结合ECD谱图在228 nm有1个负的Cotton效应，提示绝对构型为7,8，故鉴定化合物4为长花马先蒿苷B。

化合物5：白色无定形粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7.10 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2), 6.86 (1H, dd,= 1.7, 8.1 Hz, H-6), 6.73 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2′), 6.71 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 6.69 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5′), 6.60 (1H, dd,= 1.7, 8.2 Hz, H-6′), 5.05 (1H, d,= 7.1 Hz, H-7), 4.36 (1H, m, H-8), 4.13 (1H, d,= 7.4 Hz, H-1′′), 3.82～3.92 (3H, overlapped, H2-9, H-6′′a), 3.67 (1H, dd,= 5.9, 12.0 Hz, H-6′′b), 3.78 (3H, s, 3-OCH3), 3.72 (3H, s, 3′-OCH3), 3.53 (2H, t,= 6.5 Hz, H2-9′), 3.30～3.08 (4H, m, H-2′′～5′′), 2.57 (2H, t,= 7.9 Hz, H2-7′), 1.77 (2H, m, H2-8′)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 130.3 (C-1), 113.2 (C-2), 149.0 (C-3), 147.6 (C-4), 115.5 (C-5), 123.3 (C-6), 78.3 (C-7), 85.5 (C-8), 62.3 (C-9), 138.1 (C-1′), 114.1 (C-2′), 151.8 (C-3′), 147.4 (C-4′), 119.8 (C-5′), 121.8 (C-6′), 32.8 (C-7′), 35.7 (C-8′), 62.3 (C-9′), 100.6 (C-1′′), 75.2 (C-2′′), 78.0 (C-3′′), 71.8 (C-4′′), 78.0 (C-5′′), 62.9 (C-6′′), 56.6 (3-OCH3), 56.4 (3′-OCH3)。以上数据和文献报道一致[11]，根据9位亚甲基氢化学位移差值（∆H-9a–H-9b＜0.1）可知相对构型为赤式（）[12]，又由于在230 nm有1个负的Cotton效应，故鉴定化合物5为(7,8)-4,7,9,9′-四羟基-3,3′-二甲氧基-8--4′-新木脂素-7--β--葡萄糖苷。

化合物6：白色无定形粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7.10 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2), 6.84 (1H, dd,= 1.7, 8.2 Hz, H-6), 6.75 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5′), 6.71 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 6.66 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′), 6.53 (1H, dd,= 2.0, 8.2 Hz, H-6′), 4.86 (1H, d,= 5.2 Hz, H-7), 4.13 (1H, m, H-8), 3.84 (1H, dd,= 6.7, 11.8 Hz, H-9a), 3.73 (1H, dd,= 3.5, 11.7 Hz, H-9b), 3.82 (3H, s, -OCH3), 3.54 (2H, t,= 6.6 Hz, H2-9′), 2.54 (2H, t,= 7.5 Hz, H2-7′), 1.77 (2H, m, H2-8′)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 133.9 (C-1), 111.7 (C-2), 148.9 (C-3), 147.2 (C-4), 115.9 (C-5), 120.3 (C-6), 74.2 (C-7), 87.9 (C-8), 62.4 (C-9), 138.9 (C-1′), 117.4 (C-2′), 149.6 (C-3′), 145.8 (C-4′), 120.7 (C-5′), 120.9 (C-6′), 32.7 (C-7′), 35.7 (C-8′), 62.1 (C-9′), 56.5 (-OCH3)。以上数据和文献报道一致[18-19]，根据9位亚甲基氢化学位移差值（∆H-9a–H-9b）为0.11，可知相对构型为赤式（）[12]，结合ECD谱图在240 nm处有1个正的Cotton效应，提示绝对构型为7,8，故鉴定化合物6为(7,8)- 3-甲氧基-8,4′-氧代新木脂素-3′,4,7,9,9′-五醇。

化合物7：白色无定形粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7.04 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2), 6.72 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 6.88 (1H, dd,= 1.8, 8.2 Hz, H-6), 6.54 (2H, s, H-2′, 6′), 5.10 (1H, d,= 6.7 Hz, H-7), 4.56 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1′′), 4.21 (1H, m, H-8), 3.82 (6H, s, 3′, 5′-OCH3), 3.82 (3H, s, 5-OCH3), 3.71 (1H, dd,= 2.2, 12.0 Hz, H-6′′a), 3.57 (1H, dd,= 5.2, 12.0 Hz, H-6′′b), 3.53 (2H, overlapped, H2-9′), 3.25～3.34 (4H, overlapped, H-2′′～5′′), 3.15 (2H, m, H2-9), 2.61 (2H, t,= 1.5 Hz, H2-7′), 1.79 (2H, m, H2-8′)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 132.0 (C-1), 112.6 (C-2), 148.7 (C-3), 147.3 (C-4), 115.8 (C-5), 121.4 (C-6), 82.4 (C-7), 87.1 (C-8), 61.2 (C-9), 134.5 (C-1′), 106.9 (C-2′), 154.4 (C-3′), 140.4 (C-4′), 154.4 (C-5′), 106.9 (C-6′), 33.6 (C-7′), 35.6 (C-8′), 62.2 (C-9′), 105.4 (C-1′′), 75.7 (C-2′′), 78.2 (C-3′′), 71.5 (C-4′′), 77.9 (C-5′′), 62.6 (C-6′′), 56.8 (3′, 5′-OCH3), 56.5 (5-OCH3)。以上数据和文献报道一致[20]，可知相对构型为苏式（），结合ECD谱图在229 nm有1个正的Cotton效应，提示绝对构型为7,8，故鉴定化合物7为红叶藤苷。

化合物8：白色无定形粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7.08 (1H, dd,= 1.8, 5.1 Hz, H-2), 7.13 (1H, dd,= 5.9, 8.4 Hz, H-5), 6.91 (1H, ddd,= 1.8, 6.8, 8.4 Hz, H-6), 6.54 (2H, brs, H-2′, 6′), 4.95 (1H, d,= 5.2 Hz, H-7), 4.88 (1H, dd,= 2.6, 7.3 Hz, H-1′′), 4.18 (1H, m, H-8), 3.88 (1H, m, H-6′′a), 3.87 (1H, overlapped, H-9a), 3.85 (3H, s, 3-OCH3), 3.80 (6H, s, 3′, 5′-OCH3), 3.69 (1H, m, H-6′′b), 3.57 (2H, t,= 6.0 Hz, H2-9′), 3.37～3.54 (5H, overlapped, H-9b, H-2′′～5′′), 2.64 (2H, t,= 7.5 Hz, H2-7′), 1.83 (2H, m, H2-8′)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 137.6 (C-1), 112.4 (C-2), 150.6 (C-3), 147.3 (C-4), 117.6 (C-5), 120.8 (C-6), 73.9 (C-7), 87.4 (C-8), 61.5 (C-9), 140.1 (C-1′), 106.9 (C-2′, 6′), 154.5 (C-3′, 5′), 134.7 (C-4′), 33.6 (C-7′), 35.6 (C-8′), 62.6 (C-9′), 103.0 (C-1′′), 75.0 (C-2′′), 78.3 (C-3′′), 71.4 (C-4′′), 77.9 (C-5′′), 62.3 (C-6′′), 56.8 (3-OCH3), 56.7 (3′, 5′-OCH3)。以上数据和文献报道一致[21]，可知相对构型为赤式（），结合ECD谱图在227 nm和273 nm处各有1个负的Cotton效应，提示绝对构型为7,8，故鉴定化合物8为(7,8)-1-[4--(β--吡喃葡糖糖基)-3-甲氧基苯基]-2-[4-(3-羟丙基)-2,6-二甲氧基苯氧基]-1,3-丙二醇。

化合物9：白色无定形粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 6.79 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2′), 6.62 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5′), 6.40 (1H, dd,= 1.8, 8.2 Hz, H-6′), 6.70 (1H, s, H-8), 6.34 (1H, s, H-5), 4.28 (1H, overlapped, H-1′′), 4.26 (1H, overlapped, H-4), 3.87 (1H, d,= 11.3 Hz, H-6′′a), 3.83 (3H, s, 7-OCH3), 3.80 (1H, overlapped, H-3a1), 3.78 (3H, s, 3′-OCH3), 3.66 (1H, dd,= 5.3, 11.9 Hz, H-6′′b), 3.58 (2H, m, H2-2a), 3.46 (1H, dd,= 6.7, 9.9 Hz, H-3a2), 3.25～3.35 (4H, overlapped, H-2′′～5′′), 2.92 (1H, dd,= 5.6, 16.9 Hz, H-1a), 2.68 (1H, dd,= 10.7, 16.8 Hz, H-1b), 2.25 (1H, m, H-3), 2.03 (1H, m, H-2)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 33.4 (C-1), 35.5 (C-2), 65.3 (C-2a), 42.2 (C-3), 71.7 (C-3a), 46.7 (C-4), 117.2 (C-5), 145.9 (C-6), 147.9 (C-7), 112.4 (C-8), 128.7 (C-9), 133.2 (C-10), 135.9 (C-1′), 115.5 (C-2′), 148.2 (C-3′), 145.6 (C-4′), 115.7 (C-5′), 124.4 (C-6′), 104.7 (C-1′′), 75.6 (C-2′′), 78.3 (C-3′′), 71.7 (C-4′′), 78.2 (C-5′′), 63.1 (C-6′′), 56.4 (3′-OCH3), 56.6 (7-OCH3)。以上数据和文献报道一致[22]，故鉴定化合物9为密穗马先蒿苷。

化合物10：白色无定形粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 6.74 (1H, s, H-2, 2′, 6, 6′), 4.97 (1H, d,= 8.4 Hz, H-7, 7′), 3.87 (12H, s, 3, 3′, 5, 5′-OCH3), 3.72 (2H, dd,= 3.6, 11.4 Hz, H-9a, 9′a), 3.63 (2H, dd,= 4.8, 11.4 Hz, H-9b, 9′b), 2.31 (1H, m, H-8, 8′)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 134.4 (C-1, 1′), 104.9 (C-2, 2′, 6, 6′), 149.4 (C-3, 3′, 5, 5′), 136.3 (C-4, 4′), 84.7 (C-7, 7′), 55.3 (C-8, 8′), 61.7 (C-9, 9′), 56.9 (3, 3′, 5, 5′-OCH3)。以上数据和文献报道一致[23]，故鉴定化合物10为淫羊藿醇A2。

4 神经细胞保护活性

取处于对数生长期的PC12细胞，用含有10%血清的培养基稀释成1×105个/mL的细胞混悬液，每孔100 μL加入到96孔板中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。24 h后取出96孔板，弃培养基，药物组向每孔加入100 μL含有10 μmol/L化合物1～10的DMEM培养基、模型组加入DMEM培养基，空白组加入含血清的DMEM培养基，继续在孵箱中培养48 h之后，每孔加入10 μL MTT，并避光保存4 h。随后，加入三联溶解液 [由10 g 十二烷基硫酸钠、0.1 mL盐酸（10 mol/L）和5 mL异丙醇定容至100mL配制] 100 μL。6～8 h后，在570 nm下测定吸光度（）值。每组设置3个复孔，重复3次，计算细胞存活率。结果表明，相对于模型组的PC12细胞存活率62.28%，化合物1（10 μmol/L）能将细胞存活率提升至68.22%（＜0.05），表现出一定的神经细胞保护活性。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Studies on lignans from

ZHANG Jia, YANG Ya-nan, JIANG Jian-shuang, FENG Zi-ming, YUAN Xiang, ZHANG Xu, ZHANG Pei-cheng

State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To investigate the chemical constituents ofand evaluate their neuroprotective activities by PC12 cell model.Firstly, the dried plant ofwere extracted by 80% ethanol aqueous. Then, the compounds were isolated and purified by a variety of chromatographic techniques including HP-20 macroporous resin, ODS, silica gel, Sephadex LH-20, and semi-preparative HPLC. The structures of the isolates were determined by a combination of HR-ESI-MS, NMR, and ECD spectra. Finally, the neuroprotective activities of isolates were tested.Ten lignans were isolated and identified as pilosaneolignan ester (1), pilosaneolignanside A (2), picraquassioside C (3), longifloroside B (4), (7,8)-4,7,9,9′-tetrahydroxy-3,3′- dimethoxy-8,4′-oxyneolignan-7--β--glucoside (5), (7,8)-3-methoxy-8,4′-oxyneoligna-3′,4,7,9,9′-pentol (6), rourinoside (7), (7,8)-1-[4--(β--glucopyranosyl)-3-methoxyphenyl]-2-[4-(3-hydroxy-propyl)-2,6-dimethoxyphenoxy]-1,3-propanediol (8), densispicoside (9), and icariol A2(10).The structures of 1 and 2 are new compounds, compounds 3–10 are isolated fromfor the first time. Notably, compounds 1a and 1b represent a pair of interchangeable 8,4′-oxyneolignan glucose ester with the opposite hemiacetal hydroxy. Compound 1 exhibits the moderate protective effect on injury induced by serum deprivation in PC12 cells at 10 μmol/L.

Ledeb.; 8,4′-oxyneolignan; structural interconversion; pilosaneolignan ester; pilosaneolignanside A; neuroprotective activity; PC12 cells

R284.1

A

0253 - 2670(2021)17 - 5176 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.007

2021-07-26

中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2019-I2M-1-005）

张 佳，男，沈阳药科大学78期中药学专业校友，主要从事天然药物化学研究。E-mail: zhangsir0726@163.com

张培成，男，沈阳药科大学1996级博士药物化学专业校友，二级教授，研究方向为天然药物化学。Tel/Fax: (010)63165231 E-mail: pczhang@imm.ac.cn

[责任编辑 王文倩]