UPLC-MS／MS法测定化妆品中丙烯酰胺的不确定度评定

曹海荣，薛晓康，李晓宇

（1.上海应用技术大学 化学与环境工程学院，上海 201418；2.上海化工研究院有限公司，上海 200062）

1 引言

丙烯酰胺是一种长期接触会导致人和动物的神经系统损伤并具有潜在的遗传和生殖毒性的物质［1～3］，国际癌症研究机构（IARC）1994年对丙烯酰胺的致癌性进行了评价，将丙烯酰胺列为2A类致癌物，即人类可能致癌物［4］。丙烯酰胺合成的聚合物即聚丙烯酰胺在化妆品中具有多种用途，可用作稳定剂、发泡剂、结合剂、增稠剂、成膜剂、抗静电剂和头发定型剂等［5］。聚合反应不完全时，化妆品中就可能残留有丙烯酰胺。此外，面膜产品中丙烯酰胺还可能来源于面膜纸［6］。我国《化妆品安全技术规范》（2015年版）将丙烯酰胺列为化妆品禁用组分，并公布了检测方法［7］。

测量不确定度是对测量结果质量的定量表征，其测量结果的可用性很大程度上取决于其不确定度的大小［8～12］。郑丽敏［3］采用溴化衍生-气相色谱法测定丙烯酰胺含量并进行不确定度评定；林金美［4］采用高效色谱法测定纺织品中丙烯酰胺含量并进行不确定度评定；陈东洋等［1］采用高效液相色谱-串联质谱法测定饮用水中丙烯酰胺含量并进行不确定度评定；Basfar A A［13］采用核磁共振技术评价N-（异丁氧基甲基）丙烯酰胺凝胶剂量测量的不确定性。

为了保证化妆品中丙烯酰胺残留量检测结果的科学性，本文依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》［14］并参照《化妆品安全技术规范》（2015年版）中液相色谱-串联质谱法测定丙烯酰胺残留量的相关内容，建立数学模型，并对测定结果进行不确定度评估，为评定测量方法和结果的可靠性、准确性提供了科学依据。

2 实验部分

2.1 实验仪器与试剂

实验采用的仪器为Acquity UPLC® H-CLASS超高效液相色谱-Xevo TQD MS三重四级杆质谱联用仪（色谱柱为Waters Acquity UPLC® BEH C18色谱柱，1.7μm×2.1 mm×50 mm，美国Waters公司）；AL204-IC分析天平（d＝0.1 mg，瑞士梅特勒公司）；AB135-S／FACT分析天平（d＝0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；KUDOS科导超声波清洗器（上海科导超声仪器公司）；Simplicity超纯水纯化系统（美国Millipore公司）。

实验采用的试剂为甲醇，乙腈，乙酸铵（色谱纯，德国CNW Technologies公司）；丙烯酰胺标准品（纯度为99.34%）、氘代丙烯酰胺标准品（纯度为99.1%），其余试剂均为市售分析纯或以上规格，均来自上海安谱实验科技股份有限公司。

2.2 实验方法

2.2.1 色谱条件

（1）色谱柱：Waters Acquity UPLC® BEH C18色谱柱（1.7μm×2.1 mm×50 mm）。

（2）流动相：甲醇（A）和0.1%体积比的甲酸水溶液（B）梯度洗脱，洗脱程序为：0～1.5 min，A为30%；1.5～2.5 min，A由30%升至90%；2.5～3.0 min，A由90%降至30%，保持2 min。

（3）流速：0.3 mL／min。

（4）进样量：5μL。

（5）柱温：25℃。

2.2.2 质谱条件

（1）离子源：电喷雾离子源（ESI）；

（2）检测模式：多反应检测模式；

（3）干燥气流速：900 L·h－1；

（4）干燥气温度：600℃；

（5）毛细管电压：0.30 kV；

（6）锥孔流速：50 L·h－1；

（7）丙烯酰胺、氘代丙烯酰胺的质谱采集参数，见表1。

表1 丙烯酰胺、氘代丙烯酰胺的质谱采集参数Tab.1 The acquisition parameters of mass spectrometry of acrylamide and acrylamide-d3

2.2.3 标准储备溶液的配制

取丙烯酰胺标准品25.00 mg（精确到0.000 1 g），置于50 mL容量瓶中，加乙腈溶液（1∶9）使溶解并定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为500 mg／L的丙烯酰胺标准储备溶液。

2.2.4 标准曲线溶液的配制

用乙腈溶液（1∶9）稀释配制的丙烯酰胺标准储备溶液，制备浓度为100.0μg／L的丙烯酰胺标准溶液。分别取100.0μg／L的丙烯酰胺标准溶液50.0μL、200.0μL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、8.0 mL至6个10 mL容量瓶中，每个容量瓶再加入氘代丙烯酰胺标准储备溶液1.0 mL，用乙腈溶液（1∶9）定容、摇匀，得到外标为0.5μg／L、2.0μg／L、10.0μg／L、20.0μg／L、50.0μg／L、80.0μg／L的标准溶液，进行超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS／MS）法分析。

2.2.5 样品处理

取0.2 g（精确到0.000 1 g）溶液置于10 mL玻璃试管中，加浓度为100.0 mg／L的内标溶液200μL，超声提取30 s；然后加0.02 mol／L的醋酸铵水溶液0.15 mL，超声提取30 s；再加2.0 mL乙腈（1∶9），超声提取11 min；取上清液，氮气吹干，残渣加2 mL色谱流动相（甲醇）溶解，超声提取6 min；经0.45μm微孔滤膜过滤后，滤液作为待测溶液，备用。

2.2.6 样品检测

用UPLC-MS／MS法分析标准溶液，以丙烯酰胺峰面积与氘代丙烯酰胺峰面积之比对丙烯酰胺浓度做标准曲线。待测样品用同样的方法分析后，将样品的峰面积比值代入标准曲线，计算得到待测溶液的浓度，最后计算得到样品中丙烯酰胺的浓度。

2.3 仪器校准证书

本实验中涉及的所有仪器均经过苏州市计量研究所计量并颁发校准证书。所有的计量允许误差均从此计量证书中获得。

2.4 数学模型

根据样品测试方法的过程，建立样品中丙烯酰胺残留量测定的不确定度评估数学模型为：

式中：X为样品中丙烯酰胺的含量，mg／kg；C为待测样品液中丙烯酰胺的浓度，μg／L；V为样品液定容体积，mL；m为样品质量，g。

2.5 测量不确定度的来源

结合数学模型和测试方法，对样品中丙烯酰胺测定结果有影响的各种不确定度分量的来源进行分析，由图1可知具体引入的不确定度来源。由于本文采用内标法测量样品中丙烯酰胺含量，仪器波动、内标储备液的配制不会引入不确定度。

图1 超高效液相色谱-串联质谱测定化妆品中丙烯酰胺含量的不确定度来源Fig.1 Determination of uncertainty of acrylamide content in cosmetics by UPLC-MS／MS.

3 实验结果

3.1 测量重复性引入的相对标准不确定度urel（X）

在空白化妆品中添加丙烯酰胺、氘代丙烯酰胺标准溶液，得到含丙烯酰胺为49.28μg／L的化妆品试样，即阳性样品。在相同的条件下采用相同的方法平行测定6次，测试结果如表2所示。

表2 样品中丙烯酰胺含量X的结果表Tab.2 The content of acrylamide in the sample

测量重复性引入的标准不确定度u（X）由式（2）计算得到。

式中：n为测量次数；Xi为每次测量得到的丙烯酰胺含量；为n次测量的丙烯酰胺含量的平均值。

测量重复性引入的相对不确定度urel（X）由式（3）计算得到。

将表2中数据代入式（2）计算可得：

将u（X）计算值代入式（3）计算可得：

3.2 样品称量引入的相对标准不确定度urel（m）

仪器校准证书表明天平最大允许误差为0.000 1 g，按均匀分布，取0.200 5 g化妆品样品引入的标准不确定度u（m）和相对标准不确定度urel（m）分别为：

3.3 样品溶液定容引入的相对标准不确定度urel（V）

用1 000μL移液枪取甲醇将试样定容至2 mL，仅考虑体积引入的不确定度，由温度引入的不确定度可以忽略。

校准证书表明1 000μL移液枪的最大误差为±1%，即0.01 mL，按均匀分布，样品溶液定容过程中使用1次移液枪引入的标准不确定度u1（V）和相对标准不确定度u1rel（V）分别为：

定容过程需使用2次移液枪，则样品溶液定容引入的相对标准不确定度为：

3.4 样品溶液浓度测量引入的相对标准不确定度urel（C）

3.4.1 外标标准溶液配制引入的相对标准不确定度urel（CSTD）

（1）丙烯酰胺储备液配制产生的相对标准不确定度urel（C1）

（a）标样丙烯酰胺纯度引入的相对标准不确定度urel（pSTD）

由标准物质证书可知，丙烯酰胺纯度引入的扩展不确定度uexp（pSTD）为0.32%，取包含因子k＝2，丙烯酰胺纯度pSTD为99.34%，则由丙烯酰胺纯度引入的标准不确定度u（pSTD）和相对标准不确定度urel（pSTD）分别为：

（b）标样丙烯酰胺称量引入的相对标准不确定度urel（mSTD）

仪器校准证书表明天平最大允许误差为0.000 01 g，按均匀分布，称取0.024 84 g丙烯酰胺标样mSTD引入的标准不确定度u（mSTD）和相对标准不确定度urel（mSTD）分别为：

（c）标准丙烯酰胺储备液定容体积引入的相对标准不确定度urel（VSTD1）

用50 mL容量瓶将丙烯酰胺试液定容至50 mL，引入的不确定度包括体积、温度变化以及估读误差。

仪器校准证书表明50 mL容量瓶的最大允许误差为0.05 mL，按均匀分布，标准丙烯酰胺储备液定容过程中体积变化引入的不确定度u（VV，STD1）为：

校准温度为20℃，实验室环境温度为（20±5）℃，水的体积膨胀系数为2.08×10－4℃－1，按均匀分布，标准丙烯酰胺储备液定容过程中温度变化引入的不确定度u（VT，STD1）为：

人眼观测容量瓶刻度线引入的不确定度：人员读数允许有0.01 ml误差，假定其为三角分布［15～17］，则标准丙烯酰胺储备液定容过程中估读误差引入的不确定度u（VR，STD1）为：

定容过程只需使用一次容量瓶，则标准丙烯酰胺储备液定容引入的标准不确定度u（VSTD，1）和相对标准不确定度urel（VSTD，1）分别为：

则丙烯酰胺储备液配制产生的相对标准不确定度urel（C1）为：

（2）丙烯酰胺储备液稀释产生的相对标准不确定度urel（C2）

用200μL的可调移液枪取20μL储备液置于100 mL容量瓶中，用乙腈水溶液（1∶9）定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为98.565 1μg／L的稀释后的丙烯酰胺储备液标准工作溶液。该过程产生的不确定度主要来源于移液枪和容量瓶。

（a）由移液枪引入的不确定度

按照均匀分布处理，由移液枪引入的不确定度仅考虑体积变化。校准证书表明200μL的移液枪取20μL溶液允许的最大误差为±4%，即8×10－4mL，按均匀分布，则丙烯酰胺储备液稀释过程中使用1次移液枪引入的标准不确定度u（V0.02，STD2）和相对标准不确定度urel（V0.02，STD2）分别为：

（b）由容量瓶引入的不确定度

由容量瓶引入的不确定度包括体积、温度变化及估读误差。校准证书表明100 mL容量瓶的最大允许误差为0.1 mL，按均匀分布，则丙烯酰胺储备液稀释过程中体积变化引入的不确定度u（V100，STD2）为：

校准温度为20℃，实验室环境温度为（20±5）℃，水的体积膨胀系数为2.08×10－4℃－1，按均匀分布，则标准丙烯酰胺储备液稀释过程中温度变化引入的不确定度u（VT，STD2）为：

人员读数允许有0.01ml误差，假定其为三角分布［15］，则人眼观测容量瓶刻度线引入的不确定度u（VE，STD2）为：

定容过程只需使用1次容量瓶，则标准丙烯酰胺储备液稀释引入的标准不确定度u（V′100，STD2）和相对标准不确定度urel（V100，STD2）分别为：

则由丙烯酰胺储备液稀释产生的相对标准不确定度urel（C2）为：

（3）丙烯酰胺标准系列溶液配制过程引入的不确定度urel（C3）

根据标准溶液配制过程，取50μL、200μL、1 mL、2 mL、5 mL、8 mL各1次，10 mL容量瓶定容6次。按照前述的方法计算，由丙烯酰胺标准系列溶液配制过程引入的不确定度分量详见表3。

表3 标准系列溶液配制过程中引入的不确定度Tab.3 The uncertainty introduced by the preparation of standard series solution

校准证书表明10 mL的容量瓶的最大允许误差为0.02 mL，按均匀分布，标准系列溶液配制过程中体积变化引入的不确定度u（V10，STD3）为：

校准温度为20℃，实验室环境温度为（20±5）℃，水的体积膨胀系数2.08×10－4℃－1，按均匀分布，则标准系列溶液配制过程中温度变化引入的不确定度u（VT，STD3）为：

人员读数允许有0.01 mL误差，假定为三角分布［15］，则人眼观测容量瓶刻度线引入的不确定度u（VR，STD3）为：

标准系列溶液配制过程中需要使用6次10 mL的容量瓶，则由丙烯酰胺标准系列溶液配制过程引入的不确定度urel（C3）为：

则外标标准溶液丙烯酰胺配制引入的相对标准不确定度urel（CSTD）为：

3.4.2 标准曲线拟合引入的不确定度urel（C4）

制备6个梯度标准溶液，每个浓度测定3次，以标准溶液质量浓度Ci为横坐标，以标准溶液外标峰面积（A1）与内标峰面积（A2）的比值A1／A2为纵坐标，用最小二乘法拟合，获得线性回归方程y＝a×C＋b和线性相关系数r，列于表4中。方程中a＝1.09×10－4，b＝1.43×10－4，a为拟合曲线的斜率，b为拟合曲线的截距。

表4 标准曲线数据表Tab.4 The data of Standard curve

线性回归方程和线性相关系数分别为：

取1份阳性样品，进行6次重复测定，得到平均浓度为50.3μg／L，则拟合引入的标准不确定度u（C4）为：

式中：S为标准溶液峰面积残差的标准差，按式（5）计算；a为拟合曲线的斜率；p为样品测定总次数，p＝6；n为标准曲线溶液测定总次数，n＝18为n次标准溶液浓度的平均值，μg／L，按式（6）计算；C0，sample为阳性样品溶液中丙烯酰胺的平均浓度，μg／L，按式（7）计算；Ci，STD为标准溶液中丙烯酰胺的测定值，μg／L。

式中：b为拟合曲线的截距；yi，STD为标准溶液的峰面积比A1／A2。

将参数代入式（5）～式（7）可分别求得：

从而得

标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel（C4）为：

3.4.3 内标标准溶液配制引入的相对标准不确定度urel（CIS）

由于内标溶液浓度不参与定量计算，所以内标溶液配制不引入不确定度。仅考虑氘代丙烯酰胺溶液加入体积产生的不确定度。氘代丙烯酰胺溶液加入体积产生的相对标准不确定度为urel（CIS）。用1 000μL移液枪加入内标，仅考虑体积引入的不确定度，由温度引入的不确定度可以忽略。

校准证书表明1 000μL移液枪的最大误差为±1%，即0.01 mL，按均匀分布，则氘代丙烯酰胺溶液使用一次移液枪引入的标准不确定度u（VIS）和相对标准不确定度urel（VIS）分别为：

用1 000μL移液枪加入内标，需使用6次移液枪，则氘代丙烯酰胺溶液加入体积产生的相对标准不确定度urel（CIS）为：

则样品溶液浓度测量引入的相对标准不确定度urel（C）为：

3.5 回收率引入的相对标准不确定度urel（R）

取0.2 g化妆品样品，加入1 mL浓度为100.0μg／L的丙烯酰胺标准液，200μL浓度为100.0 mg／L氘代丙烯酰胺标准液，定容至2mL，得到丙烯酰胺浓度为50.0μg／L的待测液，进行回收试验。根据表5中6次添加回收率的测定结果，计算平均加标回收率与标准偏差，从而计算标准不确定度u（R）和相对标准不确定度urel（R），计算式分别为式（8）和式（9）。

式中：n为测量次数；Ri为每次测量的丙烯酰胺回收率为n次测量的丙烯酰胺回收率的平均值。

将表5中各参数代入式（8）可求得u（R）＝1.71%，从而：

表5 加标回收实验结果Tab.5 The result of recovery experiment

3.6 相对合成标准不确定度urel（w）及合成不确定度uc（w）

UPLC-MS／MS法测定化妆品中丙烯酰胺的相对不确定度分量见表6。

表6 各分量的相对标准不确定度Tab.6 The relative standard uncertainty of each component

相对合成标准不确定度urel（w）按式（10）计算。

将表6中参数代入式（10）可得：

合成不确定度u（w）按式（11）计算。

将已知参数代入式（11）可得：

3.7 扩展不确定度U（w）及结果表示

根据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》取95%的置信概率，包含因子k＝2，则丙烯酰胺含量的扩展不确定度U（w）为：

UPLC-MS／MS法测定化妆品中丙烯酰胺含量的不确定结果，见表7。用UPLC-MS／MS法测定化妆品中丙烯酰胺的含量为X＝0.502±0.066 mg／kg（k＝2，置信区间p＝95%）。

表7 丙烯酰胺不确定度测定结果报告Tab.7 The result of uncertainty determination of acrylamide

4 结论

通过对化妆品中丙烯酰胺含量的不确定度评定，得出样品中丙烯酰胺的含量为（0.502±0.066）mg／kg，k＝2，置信概率P＝95%。较全面地分析了UPLC-MS／MS法测定丙烯酰胺含量全过程不确定度的来源，并计算了各不确定度分量。分析表明，样品溶液浓度测量和回收率是合成不确定度的主要来源；在样品溶液浓度测量过程中由标准溶液配制和标准曲线拟合引入的不确定度所占比例较大。因此，在日常检测中可优化溶液配制的方法、处理全过程所使用的仪器、试剂、环境都必须达到标准要求，不断提高操作人员的熟练程度；以减小测量结果的不确定度，提高检测结果的准确性。