豌豆细菌性疫病菌的分类与检测技术研究进展

许萍萍 刘晓宇 许忠祥 杨静 周密密 钱茱希 李彬 吴翠萍 安榆林

摘要：由丁香假单胞菌豌豆致病变种引起的豌豆细菌性疫病可引起寄主植物花梗、花和豆荚等萎蔫枯死，导致植株猝倒，对产量影响较大。目前在世界各豌豆重要生产区广泛发生并严重危害，至今尚无有效防治措施。为防范该病菌随着豌豆进口传入我国，需要提高对该病菌的认识，研制更加快速、高效的检测方法。丁香假单胞菌豌豆致病变种与适合致病变种等9个致病变种组成基因型Ⅰ。根据丁香假单胞菌豌豆致病变种与不同豌豆品种致病性的不同，该变种又可分为8个生理小种。利用该病菌特异性片段设计的引物进行PCR扩增产物的不同，可将上述8个生理小种分为2个系统发育群。目前，对该病菌的鉴定主要通过常规的生理生化方法和环介导等温及多位点序列分析等分子生物学方法。上述检测方法存在检测周期长、检测效率低，且不能快速区分阳性结果是否来源于病原菌活细胞或死细胞等问题。可通过探索建立实时荧光PCR和数字PCR检测方法，来实现快速准确鉴定目标菌种，并对供试菌株的活性进行鉴定的目标。

关键词：豌豆;豌豆细菌性疫病病菌;病害;丁香假单胞菌豌豆致病变种;分类;检测

中图分类号：S436.43   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）13-0046-05

豌豆细菌性疫病为我国禁止进境植物检疫性细菌病害，由丁香假单胞菌豌豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. pisi）侵染引起，1915年首次报道在美国科罗拉多州发生[1]，至今已有百余年。随后该病害迅速扩散至世界各豌豆重要生产区，我国尚无分布。该病菌可引起寄主植物花梗、花和豆荚等萎蔫枯死，导致植株猝倒，早期侵染即可造成严重损失，对豌豆产量影响较大[2]。

豌豆细菌性疫病菌主要随种子进行远距离传播[3]，病菌在种子表面或种子内部可存活数个生长季节，经表面药剂处理后的种子内部仍有病菌存活[4]，因此极难防治。豌豆是我国第一大食用豆进口品种，我国是全球第二大进口国，加拿大、美国是我国的豌豆主要进口国[5]。根据欧洲和地中海植物保护组织（EPPO）2020年数据，豌豆细菌性疫病在加拿大广泛分布，美国的加利福利亚州、科罗拉多州、堪萨斯州、纽约州、华盛顿州、威斯康辛州均有分布。2013年，原厦门检验检疫局从加拿大进口豌豆中检测出豌豆细菌性疫病病菌，其后也有其他口岸截获该致病菌。因此，为有效降低豌豆细菌性疫病病菌传入风险，需要进一步提高对该病菌的认识，有效加强进口豌豆种子的检疫。

1 豌豆细菌性疫病病菌的属性及分类

1.1 基本属性

豌豆细菌性疫病的病原菌为丁香假单胞菌豌豆致病变种，属于薄壁菌门（Gracilicutes）假单胞菌科（Pseudomonadaceae）假单胞菌属（Pseudomonas）丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的致病变种，属于革兰氏阴性菌。该病菌主要寄主为豌豆（Pisum sativum），自然条件下也可侵染扁豆（Lablab purpureus）、山黧豆（Lathyrus odoratus）、宽叶山黧豆（L. latifolius）、野豌豆属（Vicia spp.）植物和孟加拉野豌豆（V. benghalensis）[6]。

1.2 现有分类

1.2.1 基因型 丁香假单胞菌寄主范围广，常见的致病变种已达60多种[7-8]，种内致病变种的区分和鉴定一直是植物病原细菌鉴定中的难点。Gardan 等1999年根据 DNA-DNA 杂交和核糖体分型将 48个致病变种及相关假单胞杆菌划分为 9 类基因型，其中丁香假单胞菌豌豆致病变种与适合致病变种（P. syringae pv. aptata）、猝倒致病变种（P. syringae pv. lapsa）、疱疹致病变种（P. syringae pv. papulans）、致黑致病变种（P. syringae pv. atrofaciens）、大叶槭致病变（P. syringae pv. aceris）、黍致病变种（P. syringae pv. panici）、臭楝致病变种（P. syringae pv. dysoxyli）、日本致病变种（P. syringae pv. japonica）等 9个致病变种组成基因型1[9]。同基因型内的不同致病变种遗传关系非常接近，难以区分。

1.2.2 生理小种 Taylor等1995年通过研究该病原菌与8个不同豌豆栽培种无毒基因（A）与抗性基因（R）的相互作用将其分为7个生理小种[10]，详见表1。Martin-Sanz等2011年报道新的8号生理小种，有荧光，可扩增出272 bp条带[11]。

1.2.3 血清学分类 Grondeau等1992年使用血清学方法将供试的所有丁香假单胞菌豌豆致病变种分成3个O血清型，分别为APT-PIS、HEL2和RIB[12]。

1.2.4 2个系统发育群 Arnold等1996年找出病原菌特异性片段，并以此设计引物进行PCR扩增，所有的7个生理小种分别扩增出272 bp或132 bp片段，因此将7个生理小种分为2个系统发育群，Ⅰ群为1、5、7生理小种，Ⅱ群为2、3、4、6生理小种[13]。在这个研究中，作者还首次发现应属于Ⅱ群的3、4号生理小种的少量菌株扩增出属于Ⅰ群的条带，因此又将3、4号生理小种分为3A/B，4A/B。这个分类在Cournoyer等1996年基于HrpL基因对该病菌的DNA序列分析中得到验证[14]。丁香假单胞菌豌豆致病变种分类情况详见表2。

2 豌豆细菌性疫病病菌的检测

2.1 检测中容易混淆的近似菌

我国每年进口的豌豆95%以上来自加拿大[15] 。由于豆类对后茬作物增产效果非常显著，在加拿大，豌豆、扁豆、鹰嘴豆广泛作为小麦、油菜的前茬作物[16]。因此，进口的豌豆中极易混杂有扁豆、鹰嘴豆、小麦、油菜等的种子，在丁香假单胞菌豌豆致病变种的检测中，上述夹杂的种子容易携带的丁香假单胞菌的其他致病變种细菌需要进行排除。Lelliott等发现，荧光假单胞菌（P. fluorescens）、恶臭假单胞菌（P. putida）广泛存在于土壤中，绿黄假单胞菌（P. viridiflava）和丁香假单胞菌丁香致病变种（P. syringae pv. syringae）正常存在于植物地上部分[17]。这些细菌容易污染豌豆种子。Grondeau等发现血清学方法不能将丁香假单胞菌豌豆致病变种与丁香致病变种、绿黄假单胞菌进行区分[12]。 进口豌豆检测中容易与豌豆细菌性疫病病菌混淆的细菌详见表3。在检测进口豌豆细菌性疫病病菌时，可以通过查询表3的寄主信息和发生国家/地区信息，判断可能存在的其他假单胞菌种类。如对加拿大进口豌豆检测中，丁香假单胞菌大豆致病变种、斑生致病变种、菜豆致病变种、丁香致病变种、荧光假单胞菌、绿黄假单胞菌就是重点排除对象。

2.2 现有检测方法

2.2.1 常规生理生化方法

2.2.1.1 细菌分离 种子表面用 0.5%次氯酸钠消毒5 min，灭菌水洗3次，将消过毒的种子放在KB琼脂培养基上培养。25 ℃培养2～3 d，出现光亮黏稠隆起的菌落[18]。

2.2.1.2 生化测试

2.2.1.2.1 革兰氏判定 简单快速地进行预鉴定，可以采用KOH法，用接种环蘸取细菌和2滴3% KOH混合，若细菌变黏，则为革兰氏阴性菌，不变黏，则为革兰氏阳性菌[7]。

2.2.1.2.2 荧光色素沉着 将在含有1%酪氨酸的KB培养基上划线培养了24～48 h的细菌菌落，放紫外灯下观察荧光色素沉着。

2.2.1.2.3 过氧化氢酶 新鲜的细菌培养物放在洁净的载玻上，加1滴10%过氧化氢。该病原菌应出现有气泡产生的阳性反应。

2.2.1.2.4 硝酸盐測试 选择含硝酸盐源的培养基接种细菌分离株。培养基颜色的变化意味着细菌是厌氧，在无氧呼吸时将硝酸盐（NO-3）还原为亚硝酸盐（NO-2）。该病原菌不能降解N，因此不能产生阳性反应。

2.2.1.2.5 LOPAT试验 即果聚糖试验、氧化酶试验、马铃薯软腐试验、精氨酸双水解酶试验和烟草过敏试验。该病原菌LOPAT测试结果为果聚糖试验和烟草过敏试验阳性，氧化酶试验、马铃薯软腐试验、精氨酸双水解酶试验均为阴性。

2.2.2 血清学方法 Grondeau等1992年使用血清学方法对豌豆疫病病菌进行鉴定[3]。将供试的所有丁香假单胞菌豌豆致病变种分成3个O血清型，分别为APT-PIS（占比88.5%）、HEL2（11.4%）、RIB（0.1%）。同时指出血清学方法不能区分豌豆细菌性疫病病菌和丁香假单胞菌丁香致病变种和绿黄假单胞菌[12]。

2.2.3 分子生物学方法

2.2.3.1 环介导等温扩增（LAMP）检测法 封立平等2013年根据丁香假单胞菌豌豆致病变种的肽相关脂蛋白（oprL）特异性基因设计了2对引物FIP/BIP和F3/B，建立了丁香假单胞菌豌豆致病变种环介等温扩增检测体系，其结果表明2对引物特异性强，可特异性区分丁香假单胞菌丁香致病变种、绿黄假单胞菌、丁香假单胞菌大豆致病变种、丁香假单胞菌菜豆致病变种。其检测灵敏度比普通PCR高出100倍[19]。

2.2.3.2 多位点序列分析 陈青等2016年使用E11/E16、E22/E26等7对引物，对菌株的16S、gap1、gltA等6个序列进行 PCR 扩增和测序，并结合进行Biolog 测定、烟草过敏性反应和致病性测试，最终将菌株鉴定为豌豆细菌性疫病病菌[6]。

2.2.3.3 常规PCR技术 基于常规PCR技术对细菌的检测常以扩增病原菌基因组的核糖体基因序列16S rDNA 、16S-23S rDNA间隔区或看家基因gap1、gltA、gyrB 和 rpoD为基础，由于丁香假单胞菌的核糖体、看家基因的高度保守性，因而单纯以 16S rDNA 或看家基因为目标片段序列，设计的引物探针，很难有效鉴别丁香假单胞菌致病变种。

对于不同寄主植物有着不同的致病性是丁香假单胞菌的重要鉴别特征，致病基因以及致病相关基因很可能作为丁香假单胞菌不同菌株以及致病变种的分类鉴定指标。丁香假单胞菌通过获得hrp基因簇从而发展成植物病原菌[20]。植物病原细菌的hrp基因参与对寄主植物的致病性反应以及激发对非寄主植物的过敏性反应。Inoue等分别于2000年和1999年发现hrpS、hrpA、hrpZ以及hrpB基因在不同丁香假单胞菌菌株之间的排列顺序始终一致，有着高度同源，对于丁香假单胞菌分组鉴定有着重要的意义[21-22]。控制丁香假单胞菌变种产生乙烯的是位于丁香假单胞菌的一个原源质粒上的efe基因，Weingart 等1999年基于efe基因设计了引物 EFEP1/EFEP2用于检测丁香假单胞菌豌豆致病变种[23]。

2.2.3.4 红外光谱检测 徐晓鸥等2014年使用红外光谱技术，利用菜豆晕疫病病菌和豌豆细菌性疫病病菌在3 000～4 000 cm-1内，分别具有特异性峰位，来鉴定2种菌。该方法检测周期仅为2 h左右，检测步骤简洁，样品前处理便捷[24]。

总之，在该病原菌的检测上，生理生化方法耗费时间较长，同时一些理化鉴定结果易于因为主观上的差异从而不能客观反映不同致病变种之间的差异。近些年，在分子生物学检测方法上，进行了较多的尝试，但存在特异性不足、缺乏对病原菌的活性判定等问题。

3 问题与展望

丁香假单胞菌寄主范围广，且有众多的致病变种，致病变种的区分和鉴定一直是植物病原细菌鉴定中的难点。现有的丁香假单胞菌豌豆致病变种的检测方法存在检测周期长、检测效率低且不能快速区分阳性结果来源与病原菌活细胞或死细胞等缺点，从而影响口岸通关效率。

使用实时荧光PCR，根据不同致病变种丁香假单胞菌基因组中特定基因序列的差异性，设计特异性引物，可快速、精准鉴别目标致病变种，并具有较高的灵敏度。包奇等2016年建立的基于实时荧光定量PCR技术检测桑丁香假单胞菌的方法，从供试的29株菌株中特异性检测出桑丁香假单胞菌，检测极限可达普通PCR的1/1 000[25]。

相对于实时荧光PCR技术，数字PCR技术具有特异性更高、灵敏度更好、无需外部标准的绝对定量等优点，其检测结果一般不受扩增效率的影响，对PCR抑制物的耐受性也比较高，因此重复性也更好[26]。田茜等2018年建立了水稻细菌性条斑病病菌和白叶枯病病菌数字PCR检测方法，均可特异性检测到目标病菌的供试菌株;同时发现，当浓度达到数字PCR的检测下限时，实时荧光PCR的CT值均为35，处于结果判断的临界值，很难得到准确的结果，而相对的在利用数字 PCR 检测体系对浓度较低的样品进行检测时，虽然阳性微滴数较少，但是可以得到准确的靶标分子拷贝数等数值，这个特性对于实现微量病原菌的快速准确检测具有十分重要的意义[27]。数字PCR的绝对定量技术可用于对供试菌株死活的快速判定。作为全新的技术手段，数字PCR存在仪器昂贵、测试成本较高等问题[28]。因此，建议在对丁香假单胞菌豌豆致病变种的检测中，可探索建立实时荧光PCR和数字PCR检测方法，以实现快速准确鉴定目标菌种，并对供试菌株的活性进行鉴定。

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