耐热保护剂提高鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗保存效果研究

刘青涛 卢凤英 汪爱芬 尹秀凤 朱秀同 何平有 赵玉龙 朱晓玮 薛家宾 张小飞

摘要：为提高鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗的耐热性能，根据前期研究设计了3个耐热保护剂配方，比较不同配方对疫苗的抗原冻干损失、温度耐受性和保存期的影响。结果显示，保护剂TS11、TS37、TS51所制备疫苗的抗原冻干损失均在0.5 lg以下，相互之间差异不明显。但TS37所制备疫苗在37 ℃和45 ℃耐受后的抗原效价下降滴度明显低于TS11和TS51，这说明TS37具有更好的耐热保护效果。另外，25 ℃、2～8 ℃保存试验显示，配方TS37可使疫苗在室温下至少能保存1个月、冷藏条件下至少保存27个月而抗原含量和攻毒保护仍能达到质量标准要求。因此，本试验研制成功针对鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗的耐热保护剂TS37，该保护剂可使疫苗实现2～8 ℃下长期保存。

关键词：耐热保护剂;鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗;保存效果

中图分类号：S852.5   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）13-0152-05

鸡新城疫和传染性支气管炎是危害我国养鸡业的主要传染病[1]。鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗（La Sota+H120株）是目前应用最广的鸡用活疫苗，在预防鸡新城疫和传染性支气管炎中发挥了重要作用[2]。但目前国内该疫苗的生产采用以脱脂奶粉和蔗糖为主要成分的常规冻干保护剂，疫苗必须在-15 ℃以下冷冻保存[3]，在储存、运输和使用过程中对冷链的要求高，在临床上常常发生由于达不到冷链要求所导致的疫苗免疫失败[4]，给我国养禽业造成巨大经济损失。而发达国家生产活疫苗普遍采用耐热保护剂技术，疫苗只需在2～8 ℃保存，这方便了疫苗的保存和运输[5-6]。

耐热保护剂技术是高品质兽用活疫苗制造的关键工艺技术，发达国家早在20世纪80年代就对该技术进行了研究，并且仅被少数跨国巨头企业掌握，一直处于保密状态[7-8]。虽然我们国家的兽用生物制品厂也对该技术进行了大量研究，但是由于技术封锁和起步较晚目前能用于规模化生产的兽用耐热保护剂活疫苗的种类还比较少[9]，特别是能用于鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗（La Sota+H120株）规模化生产的耐热保护剂技术仍然缺乏。为此，笔者于2005—2019年在江苏省农业科学院兽医所和兆丰华生物科技（南京）有限公司针对该疫苗进行了耐热保护剂研究，对耐热保护剂对疫苗的温度耐受性、保存期和免疫保护效果的影响进行了评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 制苗与检验用毒种 鸡新城疫病毒（La Sota株）和传染性支气管炎病毒（H120株）制苗用鸡胚液，鸡新城疫病毒强毒（CVCC AV1611株），鸡传染性支气管炎病毒强毒（M41株）;均由兆丰华生物科技（南京）有限公司提供。

1.1.2 主要试剂 谷氨酸钠，购自国药集团化学试剂有限公司;聚乙烯吡咯烷酮、明膠、蔗糖等，购自Sigma公司。

1.1.3 鸡胚与实验动物 SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司;SPF鸡由SPF鸡胚孵化，在隔离器内饲养至21日龄用于试验。

1.2 方法

1.2.1 耐热保护剂疫苗的制备 在前期筛选的基础上，用谷氨酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、蔗糖等基质，通过自主开发的“兽用疫苗耐热保护剂配方设计软件”获得TS11、TS37、TS51这3个保护剂配方。每个配方均有A、B这2个部分组成，A部分主要为不耐热基质，过滤除菌;B部分由耐热基质组成，高压灭菌;A和B按体积比1 ∶ 4混合即为耐热保护剂。耐热保护剂与鸡新城疫病毒La Sota株鸡胚液、鸡传染性支气管炎病毒H120株鸡胚液按体积比 1 ∶ 1 ∶ 1 进行混合，3 mL/瓶，分装至7 mL西林瓶，进行冷冻干燥。每个配方均制备3批疫苗，对疫苗的抗原冻干损失、温度耐受性和保存期等进行测定。

1.2.2 冷冻干燥效果检验 按照《中国兽药典》中质量标准的要求对疫苗的外观、真空度、剩余水分、纯净性、安全性和每羽份抗原含量进行检验和测定。

1.2.3 温度耐受性评价 将疫苗置37 ℃ 7、10、15 d，45 ℃ 3、5 d后，观察制品的外形并测定疫苗的抗原含量。

1.2.4 保存期测定 将疫苗置25 ℃ 30 d后进行病毒含量测定，同时用鸡进行效力检验。另外，将疫苗置2～8 ℃条件下保存，分别于3、6、9、12、18、24、27个月后取出，进行病毒含量测定;其中保存24、27个月的疫苗，用鸡进行效力检验。

1.2.4.1 鸡新城疫部分鸡效力检验方法 采用30日龄的SPF鸡15羽，其中10羽各滴鼻接种疫苗0.01羽份，5羽作为对照组，接种后14 d，每羽鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒强毒104.0 ELD50，观察 14 d，对照鸡全部发病死亡，免疫鸡至少保护9羽，则鸡新城疫部分判为合格。

1.2.4.2 鸡传染性支气管炎部分鸡效力检验方法 采用1～3日龄SPF鸡10羽，每羽滴鼻接种疫苗1羽份，接种后10 d，连同对照鸡10羽，用10倍稀释的鸡传染性支气管炎病毒强毒滴鼻，每羽1～2滴，观察10 d，对照鸡至少发病8羽，免疫鸡至少保护8羽，则鸡传染性支气管炎部分判为合格。

2 结果与分析

2.1 冷冻干燥结果

根据《中国兽药典》中质量标准的规定对3种耐热保护剂所制备疫苗的各项指标进行测定，由表1可知，3个保护剂配方所制备的9批疫苗的外形、剩余水分、真空度、纯净性和安全性检验均合格。由图1可知，3个保护剂配方所制备疫苗的抗原含量均达到质量标准的要求（新城疫抗原≥6.0 lg/羽份，传染性支气管炎抗原≥3.5 lg/羽份）[3]，不同保护剂所制备疫苗的抗原冻干损失差异不明显，说明3种保护剂配方对鸡新城疫和传染性支气管炎疫苗抗原均具有良好的冷冻干燥保护效果。

2.2 疫苗的温度耐受性测定结果

为比较3个配方对疫苗的耐热保护效果，将各批次疫苗分别置于37 ℃和45 ℃保存，保存一定时间后测定疫苗抗原效价，分析抗原损失情况。由表2可知，TS37所制备的鸡新城疫疫苗在37 ℃ 保存 7 d 后抗原效价仍然能达到《中国兽药典》中质量标准的要求（≥6.0 lg/羽份），而TS11和TS51所制备疫苗在37 ℃保存7 d后抗原效价均下降到6.0 lg/羽份以下;而对于抗原损失的统计分析结果（图2）显示，TS37所制备疫苗在37 ℃和45 ℃的抗原损失均显著低于TS11和TS51所制备疫苗，这说明配方TS37对新城疫抗原的耐热保护效果优于TS11和TS51。由图2、表3可知，TS37所制备鸡传染性支气管炎疫苗在37 ℃和45 ℃的抗原损失均显著低于TS11和TS51所制備疫苗，这说明配方TS37对传染性支气管炎抗原的耐热保护效果也优于TS11和TS51。

2.3 疫苗在25 ℃的保存试验结果

为比较不同耐热保护剂配方在室温条件下对疫苗抗原的保护效果，将疫苗置于25 ℃条件下保存 30 d，然后测定疫苗的抗原效价。结果（图3）显示，配方TS37所制备疫苗在25 ℃保存30 d鸡新城疫与传染性支气管炎疫苗抗原的含量均在 6.0 lg/羽份和3.5 lg/羽份以上，而配方TS11和TS51所制备疫苗的2种抗原含量均下降至6.0 lg/羽份和3.5 lg/羽份以下，这进一步说明配方TS37对鸡新城疫与传染性支气管炎疫苗抗原的耐热保护效果优于TS11和TS51。

2.4 疫苗在2～8 ℃的保存试验结果

基于疫苗的耐热效果评价结果，对配方TS37所冻干疫苗在2～8 ℃条件下的保存期进行了测定。由图4可知，疫苗在2～8 ℃条件下保存12个月鸡新城疫抗原效价未下降，18个月后新城疫抗原效价虽然有所下降，但在保存27个月后疫苗抗原效价仍然高于6.0 lg/羽份。而对传染性支气管炎抗原的测定结果显示，疫苗在2～8 ℃条件下保存27个月后，抗原效价仍然高于3.5 lg/羽份。以上结果说明， 配方TS37所冻干的疫苗在2～8 ℃条件下至少可以保存27个月。

2.5 疫苗的攻毒保护效果测定

为进一步确定配方TS37在25 ℃和2～8 ℃条件下对疫苗的保护效果，对在25 ℃保存30 d和2～8 ℃保存24、27个月疫苗的免疫保护效果用攻毒试验进行了验证。由表4可知，采用25 ℃保存30 d、2～8 ℃保存24、27个月的疫苗接种鸡后可保护鸡抵抗新城疫和传染性支气管炎病毒强毒株的攻击。这进一步说明，采用TS37所冻干疫苗在25 ℃至少可以保存30 d，在2～8 ℃至少可保存27个月。

3 讨论

疫苗免疫是我国目前进行动物疫病防控的最有效手段，疫苗质量直接关系到我国动物疫病防控的效果[10]。但目前我国兽用疫苗企业所用的制造技术在先进性上与发达国家还存在一定差距，特别是在兽用活疫苗耐热保护剂技术上差距巨大[7-9]。目前能用于规模化生产、推广的耐热保护剂活疫苗的种类并不多，并且主要集中在单苗，耐热保护剂多联活疫苗比较稀缺。对多个疫苗毒株能够同时提供保护的耐热保护剂一直是我国兽用疫苗制造行业难于突破的技术瓶颈。

本试验在前期研究的基础上设计了3个耐热保护剂配方，并比较了3个配方对鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗（La Sota+H120株）的耐热保护效果。研究结果表明，配方TS11、TS37、TS51对鸡新城疫、传染性支气管炎抗原均具有良好的冻干保护效果，冻干过程中的抗原损失均比较低。但是配方TS37所制备的疫苗在耐受高温后的抗原效价下降滴度要明显低于配方TS11、TS51，配方TS37具有更好的耐热保护性能。另外，在25 ℃保存30 d TS37所制备疫苗的抗原效价仍然能达到质量标准的要求，这说明该保护剂配方在室温条件下对疫苗抗原具有很好的保护效果，这避免了疫苗在临床应用过程中的抗原损失，有效保证了疫苗的临床应用效果[10-11]。

活疫苗能够快速诱发动物机体的先天性免疫应答和获得性免疫应答[12-13]，并且可以选择多种接种途径（汽雾、饮水、滴鼻、点眼、注射等）进行免疫[14-17]，因此在动物疫病防控中发挥了不可或缺的作用。但利用常规保护剂生产的传统活疫苗必须在-15 ℃以下保存，对冷链的要求非常严格，这大大限制了活疫苗的应用范围，并且常常由于保存、运输不当导致疫苗的抗原效价下降，从而引起免疫失败和疫病的流行。而本研究通过温度耐受性试验筛选出的配方TS37可以使鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗在2～8 ℃条件下的保存期达到27个月，这降低了疫苗在保存、运输过程中对于冷链的要求，可促进兽用活疫苗的推广利用，降低免疫失败的发生率。另外，本研究中配方TS37所制备疫苗在37 ℃保存7～10 d，鸡新城疫和传染性支气管炎抗原的效价下降均在1 lg之内，因此我们可以把37 ℃保存7～10 d作为疫苗保存期的一个快速测定方法。

综上所述，本研究中的耐热保护剂TS37可提高鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗的耐热性能，延长疫苗在室温条件下的保存期，使疫苗实现 2～8 ℃条件下的长期保存，这减少了疫苗在运输、储存、使用过程中的抗原损失，减少了疫苗免疫失败的发生，具有良好的应用前景。

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