基于电子鼻和HS-GC-MS分析温郁金源3种中药气味差异

拱健婷，李 莉，丛 悦，张金霞，王大仟，关佳莉，赵艺萌

（北京市临床药学研究所/北京市中药研究所，北京 100035）

姜科植物温郁金Curcuma wenyujinY. H. Chen et C.Ling 主产于浙江瑞安，为著名的“浙八味”之一。温郁金源中药的药用历史悠久，因其药用部位、加工方式的不同，分为3种不同的中药——温郁金、温莪术、片姜黄，称为一株三药[1]。以上3种中药均广泛应用于临床汤剂、中成药制剂中，块根蒸至透心干燥称为温郁金，长于破血化瘀；侧根茎鲜纵切厚片干燥称为片姜黄，长于破血行气；主根茎蒸熟干燥称为温莪术，长于行气止痛[2-3]，因此温郁金源中药的准确鉴别对临床精准用药至关重要。

气味鉴别在中药的品质分析中一直占有非常重要的地位。电子鼻和气-质联用技术是目前气味分析的重要研究手段。电子鼻通过对样品气味轮廓信息进行综合分析，能快速、无损地反映样品的整体气味特征，目前已被广泛应用于食品、环境监测、药品等领域[4-7]。气-质联用技术则能够实现待测样品具体挥发性成分的定性和定量分析，气-质联用与电子鼻技术的结合能够全面地分析、评价中药的气味特征。目前已有文献对温郁金源3种中药温郁金、温莪术、片姜黄的挥发性成分进行分析[8-10]，但是温郁金源中药气味电子鼻响应的物质基础研究尚无相关报道。本研究以温郁金源3种中药为研究对象，利用电子鼻对样品气味轮廓进行分析，以期为温郁金源3种中药的快速鉴别提供参考依据；为实现电子鼻分析结果的最大可能关联，采用HS-GC-MS对中药原粉气味进行测定，为温郁金源3种中药气味传感器反应机制分析提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

α-FOX3000型电子鼻（法国阿默思公司）；Agilent 7890B-5977A型气相色谱质谱仪（美国安捷伦科技公司）；TriPlus 300型顶空自动进样器（美国赛默飞世尔科技公司）；MSD Chemstation D.03.00.611色谱数据处理系统（美国安捷伦科技公司）；质谱检索数据库：NIST MS search 2.0；BSA-124S型电子分析天平（德国赛多利斯集团）；BJ-150型粉碎机（德清拜杰电器有限公司）。

温郁金源3种中药样品均购自浙江磐安浙八味市场，经北京市临床药学研究所李莉研究员依据性状特征鉴定为源于温郁金Curcuma wenyujinY. H. Chen et C.Ling植物块根及根茎的温郁金、温莪术、片姜黄。

1.2 方法

1.2.1 电子鼻检测 精密称取样品粉末（65目）0.3 g装入顶空进样瓶，压盖密封。设定电子鼻检测参数为孵化时间：600 s；孵化温度：45 ℃；进样量：1 500 μL；信号采集时间：90 s；采集周期：1 s；吹扫时间：600 s。各样品平行测定5次，记录样品的气味响应值曲线。

1.2.2 HS-GC-MS检测 精密称取样品粉末0.6 g装入20 mL顶空进样瓶中，加盖密封，放入自动进样器样品盘中。样品瓶加热温度：90 ℃；样品环温度：110 ℃；传输线温度：120 ℃；样品瓶加热时间：5 min；样品环平衡时间：0.2 min；进样时间：0.2 min。

色谱条件： Thermo TG-624色谱柱（60 m × 250 μm ×1.4 μm）；进样口温度为220 ℃；载气为氦气；柱流量为1 mL/min；分流比为5∶1；程序升温条件：初始温度为80℃，以8 ℃/min升至90 ℃，保持4 min，以6 ℃/min升到200 ℃，保持12 min。

质谱条件： 电离方式为EI，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，质量扫描范围m/z为 40 ～ 450。

1.3 数据处理方法

利用Alpha Soft V11提取12根传感器的最大响应值为特征值，采用SPSS 21.0进行方差分析，SIMCA-P 13.0进行PCA、PLS-DA分析，PLS相关性分析由Unscrambler X 10.4完成。根据NIST 14L谱库检索结果、匹配度及参考文献对HS-GC-MS 检测所得挥发性成分进行定性分析，采用峰面积归一化法确定各组分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 温郁金、温莪术、片姜黄的气味分析

2.1.1 雷达图分析 温郁金、温莪术、片姜黄样品电子鼻平均响应值的雷达图，见图1。经单因素方差分析，结果显示温郁金、温莪术、片姜黄在12根传感器上的响应值不同（P＜0.01）。 传感器阵列特征响应雷达图的差异在一定程度上反映了样品香气的差别。

图1 温郁金、温莪术、片姜黄电子鼻传感器响应值雷达图Fig.1 Radar map of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

2.1.2 主成分分析（PCA） 样品气味与电子鼻传感器的联系用电子鼻数据的PCA 双标图表示，结果见图2。结果显示PCA 主成分的累积贡献量为99.88%，说明其保留了原始数据中大部分的信息量。在PCA 模型中，各个样品分布在不同区域，表明温郁金、温莪术、片姜黄中挥发性成分气味信息具有明显差异，电子鼻能将其快速区分。同时可以看出传感器LY2/Gh、LY2/gCT1及T型、P型传感器（第二象限中传感器从左至右依次为T70/2、T30/1、PA/2、P10/1、P40/1、P10/2）倾向于温郁金，而传感器LY2/G、LY2/AA倾向于温莪术，LY2/LG和LY2/AA倾向于片姜黄。另外，Loading分析结果显示，LY2/G、LY2/AA对第一主成分的贡献率较大，LY2/Gh、LY2/gCT1对第二主成分的贡献度较大。

图2 温郁金、温莪术、片姜黄电子鼻数据主成分分析双标图Fig.2 Bioplot of PCA based on E-nose data of Curcuma Radix,Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

2.1.3 偏最小二乘判别分析（PLS-DA） 进一步将温郁金、温莪术、片姜黄的气味信息分组，建立了PLS-DA模型。PLS-DA 是一种用于判别分析的多变量统计分析方法，能凸显组间差异，利于分组[11]。采用前2个主成分t［1］和t［2］进行PLS-DA分析，获得样品分布散点图和变量VIP 图，见图3、4。PLS-DA 结果中，主成分t［1］对总方差的贡献率为71.9%，主成分t［2］对总方差的贡献率为28.1%，R2X、R2Y和Q2分别为0.999、0.998、0.998，模型有意义，且片姜黄、温莪术、温郁金能够得到有效区分。12根传感器中LY2/gCT、LY2/Gh、LY2/gCTl、LY2/LG对片姜黄、温莪术、温郁金气味差异贡献较大，为主要变量（VIP＞1），见图4。上述结果表明，片姜黄、温莪术、温郁金气味存在差异，电子鼻结合化学计量学方法能够较好地区分温郁金源3种中药。

图3 温郁金、温莪术、片姜黄3种中药PLS-DA 分析的样品分布散点图Fig.3 Score scatter plot by PLS-DA of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

图4 温郁金、温莪术、片姜黄3种中药变量的重要性差异Fig.4 VIP plot by PLS-DA of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

2.2 HS-GC-MS测定结果分析

温郁金、温莪术、片姜黄样品的总离子流图，见图5。通过化学工作站进行数据处理并利用峰面积归一化法对温郁金、温莪术、片姜黄的总离子流图中各组分的相对质量分数进行计算，使用NIST 14 L质谱数据库对各峰的质谱图进行检索，确定各个组分。结果检测到的挥发性成分共计48 种，分别从温郁金、温莪术、片姜黄中鉴定出了23、19、36种成分，三者共有成分12种，分别为α-侧柏烯、α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、d-柠檬烯、对伞花烃、桉叶油醇、2-蒈烯、樟脑、δ-榄香烯、β-榄香烯与β-石竹烯，见表1。

表1 温郁金、温莪术、片姜黄中挥发性成分的HS-GC-MS分析结果Tab. 1 Identification of the main volatile components of Curcuma Radix,Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum by HS-GC-MS

图5 温郁金、温莪术、片姜黄的HS-GC-MS总离子流图Fig.5 HS-GC-MS total ion chromatogram of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

依据化合物结构分类并计算出各类物质相对含量，如图6所示，主要挥发性物质分为烯烃类、酮类、酯类等。其中，温郁金、温莪术样品中烯烃类物质含量分别为61.96%、81.15%，在挥发性物质中含量最高，片姜黄中也含有32.77%，某些烯烃类成分对样品的气味有重要作用[12]，这些物质可能是构成温郁金源3种中药气味的基础。醇类物质仅在片姜黄中检测出，但一般认为醇类物质的阈值较高[13]，对样品的气味贡献不大。温郁金中未检测出酯类物质，而酯类物质是一类十分重要的呈香物质，阈值低[14-15]，片姜黄、温郁金、温莪术酯类物质含量差别较大，可能它们之间香气有区别的重要原因。对于酮类化合物，片姜黄、温莪术、温郁金中分别检测出6、3、1种，且在片姜黄中的含量最高。可以推测出片姜黄、温郁金、温莪术在气味上存在较大差异。

图6 片姜黄、温莪术、温郁金各类型挥发性物质分析比较结果Fig.6 The comparison results of various types of volatile components analysis of Curcuma Radix, Curcuma Rhizoma and Wenyujin Rhizoma Concisum

2.3 电子鼻气味与挥发性成分的相关性分析

为研究温郁金源3种中药产生气味的具体化学成分与电子鼻传感器的反应机制，将48种挥发性成分相对含量与电子鼻响应值作为研究对象，采用PLS法以化合物的相对含量为自变量，12个传感器的响应值为因变量进行相关性分析，结果见图7。大小椭圆分别表示50% 和100% 的方差解释，因变量均在此范围，说明可用PLS 模型很好地解释其它变量。传感器LY2/LG与LY2/AA分布在坐标图的左侧外围，剩余10根传感器均分布在坐标图的右侧外围。传感器与各化合物在图上的距离越短，代表其相关性越高。传感器LY2/G与C16（对伞花烃）紧密关联，LY2/AA与C35（2-十一烷酮）、C41（莪术呋喃二烯酮）、C44（双环大牻牛儿烯）相关性良好。在图2中可知LY2/G、LY2/AA是区分片姜黄、温莪术、温郁金的重要传感器，而C41（莪术呋喃二烯酮）、C44（双环大牻牛儿烯）为温莪术的特有成分，也是区别于片姜黄、温郁金的重要挥发性成分。同样，LY2/LG 与C2（α-侧柏烯）C6（葑烯）等多种烯烃类成分及C28（侧柏酮）、C34（左旋香芹酮）等酮类成分具有一定相关性；LY2/gCT与C47（γ-衣兰油烯），P40/1与C8（L-柠檬烯）的相关性良好。由此推测部分烯烃类、酮类成分可引起传感器LY2/G、LY2/AA、LY2/LG、LY2/gCT、P40/1的变化，从而达到区分片姜黄、温莪术、温郁金的目的。

图7 挥发性成分与电子鼻传感器相关性PLS分析图Fig.7 PLS plot showing the correlation between volatile components and sensory evaluation

3 讨论

本研究运用电子鼻和HS-GC-MS技术分别从整体香气轮廓和具体香气组分两方面检测温郁金源3种中药的气味。电子鼻的PCA和PLS-DA模型能将片姜黄、温莪术、温郁金准确区分，表明其样品间的气味特征存在明显差异，2020年版《中国药典》对片姜黄、温莪术、温郁金的气味描述分别为“气香特异”“气香或微香”“气微香”，表明建立的气味判别模型符合2020年版《中国药典》中对温郁金源3种中药的气味描述。根据传感器的特性，提示片姜黄、温莪术、温郁金中刺激传感器LY2/gCT、LY2/Gh、LY2/gCTl、LY2/LG的挥发性成分对片姜黄、温莪术、温郁金气味差异贡献较大，可能为主要香气物质。利用HS-GC-MS对香气成分作进一步研究，鉴别得到48种挥发性成分，并对其种类和相对质量分数进行统计分析得出烯烃类、酮类成分是区分片姜黄、温莪术、温郁金的主要成分。HS-GC-MS 与电子鼻的PCA 结果相一致。

4 结论

电子鼻技术可实现温郁金源3种中药的气味信息客观化，并结合化学计量学方法从整体气味角度对片姜黄、温莪术、温郁金进行良好的识别，采用HSGC-MS 技术得到温郁金源3种中药的气味电子鼻响应物质基础为烯烃类、酮类成分，为中药产生气味的物质基础与传感器反应机制提供了进一步的实验依据。