雷帕霉素介导丝裂原活化蛋白激酶信号通路对肝癌细胞的影响

巩 江 贺 学 沙 莎 戎 浩 倪士峰

（1 西藏民族大学医学院，咸阳 712082；2 西北大学生科院中药系，西安 710000）

随着肿瘤生物学研究的不断进步，靶向治疗逐渐应用于恶性肿瘤的临床研究中，雷帕霉素（rapamycin，RAPA）属于大黄内酯类药物，易溶于脂肪，能够抑制mTOR信号通路活性，多应用于脏器移植及心脑血管疾病的治疗[1]。目前，大量研究表明，雷帕霉素在胃癌及肺癌临床中具有抗肿瘤作用。丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路主要包含3种：JNK（正c-Jun氨基末端转移酶）、P38、细胞外信号调控激酶（ERK）通路，参与多种恶性肿瘤进程。研究表明，细胞因子及细胞外的刺激因子均可调节MAPK信号通路表达，促进肿瘤转移参与血脑屏障的损伤作用[2-3]。凋亡蛋白家族中，Bax可促进凋亡，Bcl-2、Bcl-xl作用与之相反，均参与癌细胞的凋亡及增殖[4]。本研究探讨雷帕霉素介导MAPK信号通路对肝癌细胞Bcl-2、Bcl-xl及Bax蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞、仪器与试剂

人肝癌细胞BEL-7402细胞（中国科学院上海细胞库）；雷帕霉素（Fermanter公司，Israel）；Bcl-2、Bcl-xl及Bax抗体（Santa Cruz公司，USA）；MAPK抗体（Abcam；USA）；流式细胞仪（常州必达科生物）。

1.2 试剂配制

MTT溶液：将MTT粉末溶于PBS缓冲液中制成5 ng/mL的溶液，低温保存。雷帕霉素：将1 mg/mL的雷帕霉素溶于DMSO中，浓度为1 000 mg/mL，低温保存。

1.3 细胞培养

将低温冷藏的BEL-7402 细胞，快速移入37℃水中溶解，离心后，离弃上清液，加入培养基，5%CO2，37.5℃保存，贴壁生长，次日更换培养基，生长到90%时，进行1∶3 传代，继续培养，取对数生长细胞进行实验。

1.4 显微镜下观察BEL-7402 细胞形态

取对数生长细胞，细胞浓度调整为5×103接种至96 孔板中，培养24 h，对照组不加入雷帕霉素干预（对照组），RAPA 处理组加入浓度20 ng/mL（20 ng/mL RAPA 组）、50 ng/mL（50 ng/mL RAPA组）、100 ng/mL（100 ng/mL RAPA 组）雷帕霉素，24 h 后，于显微镜下观察形态并拍照。

1.5 MTT 法检测BEL-7402 细胞增殖

将浓度为1 000 ng/mL 的雷帕霉素溶液采用质量分数为10 的FBS 分别调整浓度为（10、20、50、100）ng/mL，取数目为5×103/mL 接种到96 孔板中，肝癌细胞对照组未加入药物，RAPA 处理组加入以上多个浓度雷帕霉素，培养12、24、48、60 h 及72 h，结束后，在每个孔内加入20 μL MTT，4 h 后，加入150 μL DMSO，摇匀15 min，采用酶标仪于570 nm 波长检测每个孔人BEL-7402 细胞增殖。

1.6 流式细胞仪检测

将BEL-7402 细胞以5×103/mL 数量置于96 孔板，培养1 d 后，在BEL-7402 细胞内加入少量胰蛋白酶，消化4 h 后，用冷藏在-20℃的医用乙醇固定，24 h 后进行离心，弃去上清液，PBS 反复洗涤3 次，每次3～5 min，避光染色，后采用流式细胞仪分析BEL-7402 细胞凋亡程度。

1.7 免疫细胞化学检测组织MAPK 阳性表达

对对照组和RAPA 处理组BEL-7402 细胞进行爬片处理，加入2 ng/mL 多聚甲醛，固定，采用免疫细胞化学显色法检测各组MAPK 阳性表达。

1.8 免疫印迹检测Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白表达

收集对照组及RAPA 处理组BEL-7402 细胞，在96 孔板中加入100 μg 的胰蛋白酶提取液，将细胞提取液放入EP 管中，并与胰蛋白酶提取液按照1∶100 进行混合，再放入冰箱中冷冻10 min。使细胞完全裂变，成为E 溶液；在EP 管中放入BEL-7402 细胞，并按照1∶100 比例加入胰蛋白酶提取液2 mL，使细胞完全裂变，成为F 溶液；再把E和F 溶液以80∶1 的体积进行摇匀，配制成工作液，放入37.5℃的保温箱中20 min，冷却后计算Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白的浓度。

1.9 统计学处理

通过SPSS22.0 软件进行分析BEL-7402 细胞增殖、凋亡，MAPK 阳性表达，Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白相关性，数据用±s表示，行χ2或t检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAPA 对BEL-7402 细胞形态学影响

倒置显微镜观察，对照组细胞呈梭形生长，细胞质、细胞核正常。RAPA 处理组BEL-7402 细胞生长明显受到抑制，20 ng/mL RAPA 组BEL-7402细胞壁逐渐脱落，悬浮于培养液中，50 ng/mL RAPA 组 BEL-7402 细胞呈现透明度及黏附力逐渐降低，形态呈现不规则改变，细胞数目减少，100 ng/mL RAPA 组BEL-7402 细胞形成分裂小体，固缩凋亡（图1）。

图1 RAPA 对BEL-7402 细胞形态学影响，×200

2.2 雷帕霉素对BEL-7402 细胞增殖抑制率的影响

对照组BEL-7402 细胞增殖抑制率最低，RAPA 处理组BEL-7402 细胞增殖抑制率高于对照组（P<0.05）；随着时间延长及雷帕霉素浓度的升高，细胞生长抑制率逐渐升高，RAPA 干预处理100 ng/mL RAPA 组在24、48 h 及72 h 的BEL-7402细胞生长抑制率高于20 ng/mL、50 ng/mL RAPA组（P<0.05）（图2）。

图2 雷帕霉素对BEL-7402 细胞增殖抑制率的影响

2.3 雷帕霉素对BEL-7402 细胞凋亡率的影响

对照组细胞的凋亡率为7.17%，20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL RAPA 组细胞的凋亡率分别为18.89%、25.77%、38.56%。RAPA 处理组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），100 ng/mL RAPA 组凋亡率高于20 ng/mL 、50 ng/mL RAPA 组，差异有统计学意义（P<0.05），说明随着浓度的升高，BEL-7402 细胞凋亡率升高（图3）。

图3 雷帕霉素对BEL-7402 细胞凋亡率的影响

2.4 RAPA 对BEL-7402 细胞中MAPK 阳性表达率的影响

对照组BEL-7402 细胞中MAPK 阳性表达率高于RAPA 处理组（P<0.05），随着雷帕霉素浓度的升高，RAPA 处理组MAPK 阳性表达率不断降低，100 ng/mL RAPA 组中MAPK 阳性表达率低 于 组50 ng/mL RAPA 组（P<0.05），50 ng/mL RAPA 组MAPK 阳性表达率低于20 ng/mL RAPA 组（P<0.05）（图4）。

图4 BEL-7402 细胞MAPK 阳性表达率

2.5 雷帕霉素对BEL-7402 细胞中Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白水平的影响

对照组BEL-7402 细胞中Bcl-2、Bcl-xl 蛋白升高，与RAPA 处理组比较差异有统计学意义（P<0.05），RAPA 处理组Bcl-2、Bcl-xl 蛋白水平随着雷帕霉素的浓度升高而降低，两两比较存在差异（P<0.05），20 ng/mL RAPA 组 BEL-7402 细胞中Bcl-2、Bcl-xl水平高于50 ng/mL RAPA组（P<0.05），50 ng/mL RAPA 组 Bcl-2、Bcl-xl 表达水平高于100 ng/mL RAPA 组（P<0.05），Bax 水平与Bcl-2、Bcl-xl 相反（图5，表2）。

表2 RAPA 对各组细胞Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白水平的影响（n=5，±s）

表2 RAPA 对各组细胞Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白水平的影响（n=5，±s）

*P<0.05 vs 对照组；△P<0.05 vs 20 ng/mL RAPA 组；#P<0.05 vs 50ng/mL RAPA 组

组别BaxBCL-2Bcl-xl对照组0.014±0.0020.026±0.0040.031±0.005 20 ng/mL RAPA 组0.021±0.003*0.022±0.002*0.026±0.003*50 ng/mL RAPA 组0.024±0.005*△0.021±0.001*△0.023±0.002*△100 ng/mL RAPA 组0.029±0.006*△#0.015±0.001*△#0.017±0.001*△#

图5 各组细胞Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 表达水平

3 讨论

雷帕霉素最初被作为抗真菌药物，后逐渐应用于器官移植实验中，雷帕霉素对肺癌、肾癌等具有抗癌细胞扩散及增殖作用[5]。动物实验表明，RAPA 辅助用药或联合其他药物能够减少癌细胞的远处转移，主要是通过抑制血管生长因子的分化来遏制肿瘤细胞的生成和发展，对治疗恶性肿瘤患者的器官移植具有重要作用[6-7]。

肝癌细胞的发生与发展是一个复杂且多环节的过程，临床中对肝癌细胞的遏制方法主要包含减少肝癌细胞活性、抑制其增殖和迁移，诱导细胞凋亡[8]。本研究中，雷帕霉素处理组的BEL-7402细胞增殖抑制率、凋亡率随着雷帕霉素浓度升高和时间增加，细胞形态逐渐改变，癌细胞崩解坏死。雷帕霉素对肝癌细胞的抑制机制主要通过两个方面，一种是对肝癌细胞mTOR进行灭活，mTOR对肝癌细胞具有调节生物学行为的作用，并通过其他因子诱导癌细胞进行远处侵袭[9-10]。雷帕霉素具有抗肿瘤突变作用，对mTOR磷酸化的肝癌细胞药物敏感性较强，减少mTOR介导的信号转导，遏制肝癌细胞增殖，加快凋亡。另一种是减少肝癌细胞中血管生长因子表达，并已经成为研究的热点[11-12]。钱妍至等[13]研究表明，雷帕霉素对肝癌细胞具有抑制作用，具有时间剂量性，能够加快癌细胞进入凋亡期，提高细胞凋亡率，这与赵嵌嵌等[14]研究结果相似。

MAPK家族具有连接肝癌细胞受体与DNA表达之间信号调节的作用，具有促进分化及生长存活作用。其下经典的通路包含多种，在肝癌细胞中MAPK与mTOR能够相互作用，共同促进肝癌细胞激活[15]。雷帕霉素属于mTOR抑制剂，会减少MAPK与mTOR之间的激活，减少其表达。本研究中，雷帕霉素处理组BEL-7402细胞中的MAPK阳性表达率低于对照组，并随着雷帕霉素浓度的升高而减少。与毛良浩等[16]报道雷帕霉素能够抑制MAPK磷酸化，并具有较强的浓度依赖性的研究结果相似。

Bcl-2家族在多种恶性肿瘤细胞的凋亡中发挥作用，下游因子分为不同亚型，Bcl-2、Bcl-xl能够减少肝癌细胞坏死，Bax作用与之相反，具有促进肝癌细胞坏死作用，减少肝癌肿瘤坏死，延长存活期[17-18]。本研究结果显示，雷帕霉素能够抑制Bcl-2、Bcl-xl的表达，提高Bax水平，这与雷帕霉素能够加快线粒体体膜电位丢失，促进肝癌细胞凋亡有关。

综上所述，雷帕霉素能够抑制肝癌细胞增殖，加快坏死及破裂，随着雷帕霉素浓度升高，凋亡程度增大，其作用机制可能与抑制MAPK、Bcl-2、Bcl-xl 表达，促进Bax 水平升高有关。