miR-128-3p靶向调控ZEB1表达对结肠癌细胞侵袭和迁移能力的影响

马静 滕圣敏 李苓

徐州医科大学附属滕州市中心人民医院1病理科，2肿瘤科（山东滕州277500）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种常见的消化道恶性肿瘤，在全球男性和女性恶性肿瘤中的发病率分别居于第五位和第三位，病死率均位列第三［1］。新的诊断技术和治疗手段的应用虽在一定程度上降低了病死率，但伴发淋巴结转移和远距离转移的Ⅳ期CRC 患者预后仍不理想［2］。肿瘤细胞的侵袭和转移是导致CRC 患者高病死率的主要原因，因此深入研究CRC 侵袭转移的分子机制，探寻CRC侵袭转移相关分子标志物对于后续治疗和延长患者生存周期是至关重要的。miRNA是一类长度约19 ～25 nt 的内源性非编码RNA，在转录及转录后的翻译中起作用，是细胞增殖、分化、凋亡、细胞间信号传导、细胞自噬和细胞代谢等生物学过程的调节因子［3］。此外，miRNA 可发挥癌基因或抑癌基因作用，其表达水平的改变与肿瘤的发生发展密切相关［4］。miR-128-3p 是近年来新发现的一种非编码RNA，其在乳腺癌［5］、肝细胞癌［6］、前列腺癌［7］等肿瘤组织中表达水平降低并与肿瘤患者临床病理特征相关，miR-128-3p 过表达可显著抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感度［8］。目前，miR-128-3p在结直肠癌中作用及分子机制尚未明确，本研究中我们将探讨miR-128-3p 在结直肠癌中的表达及其参与结直肠癌细胞侵袭转移的机制，为该肿瘤的治疗策略提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集2015年6月至2017年5月在徐州医科大学附属滕州市中心人民医院行结直肠癌根治术的56 例患者癌组织及对应癌旁组织（距癌灶边缘＞5 cm 取材）标本，手术切除后的组织标本立即用液氮冷冻并保存于-80 ℃冰箱。56 例CRC 患者临床资料完整且术后病理组织学报告均由高年资病理医师复核，其中：男30 例，女26 例，中位年龄57 岁（30 ～77 岁）；根据美国癌症联合委员会（AJCC）第八版结直肠癌TNM分期系统进行分期：Ⅰ-Ⅱ期22 例，Ⅲ-Ⅳ期34 例；有淋巴结转移患者26 例，无淋巴结转移患者30 例；有远处移患者23 例，无远处转移患者33 例。所有患者术前均未接受放化疗及免疫治疗，并签署知情同意书。

1.2 细胞和试剂人结直肠癌细胞株（SW480、SW620、HT-29 和LoVo）和人正常结直肠上皮细胞株NCM460 均购自中国科学院上海细胞库。RPMI1640 培养基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶均购自美国Gibco 公司；TRIzol 试剂，LipofectamineTM2000 购自于美国Invitrogen 公司；miScript Primer 试剂、miScript ⅡRT 试剂盒和miScript SYBR Green PCR 试剂盒均购自德国Qiagen 公司；Transwell 小室（孔径8.0 μm）购自美国BD 公司；双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promega 公司；ZEB1 和GAPDH 兔抗人多克隆抗体购自美国Abcam 公司，羊抗兔二抗购自上海碧云天生物技术公司。PCR引物、ZEB1 过表达质粒（pcDNA3.1-ZEB1）、miR-128-3p 模拟物（mimics）及模拟物阴性对照（mimics-NC）、miR-128-3p 抑制物（inhibitor）及抑制物阴性对照（inhibitor-NC）均由上海吉凯生物技术公司设计合成。

1.3 细胞转染与分组将结直肠癌细胞SW620以2 × 105个/孔接种至6 孔培养板培养，为检测miR-128-3p 对结直肠癌细胞侵袭和迁移的影响，实验分为4 组：miR-128-3p mimics 组、mimics-NC组、miR-128-3p inhibitor 组和inhibitor-NC 组；为检测miR-128-3p调控ZEB1对结直肠癌细胞侵袭和迁移的影响，实验分为3 组：空白对照组、pcDNA3.1-ZEB1组和miR-128-3p mimics+pcDNA3.1-ZEB1组。待细胞融合度达70%～80%时，按照LipofectamineTM2000 转染试剂盒说明书将各载体转染至SW620细胞，48 h 后检测转染效率。

1.4 实时荧光定量PCR（qPCR）检测根据TRIzol说明书提取CRC 组织和细胞的总RNA，通过紫外分光光度计检测RNA 的浓度和纯度。取2 μg 总RNA 逆转录生成cDNA，反应条件为：45 ℃30 min，85 ℃10 min。在荧光定量PCR 仪上以cDNA 为模板进行扩增，qPCR 反应总体系为10 μL，反应条件为：95 ℃预热10 min，95 ℃，15 s，61 ℃，30 s，70 ℃20 s，共40 个循环。miR-128-3p 引物序列F：5′-ACACAGGTTGGGATCGGTTG-3′，R：5′-CAAACTCAACAGGCCGGGA-3′；ZEB1 引物序列F：5′-CAGCTTGATACCTGTGAATGGG-3′，R：5′-CAGCTTGATACCTGTGAATGGG-3′；内参U6 引物序列F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。扩增产物量达到临界阈值时所对应的循环数为Ct 值，△Ct 为miR-128-3p 的Ct 值与内参U6 Ct 值的差值，并以2-△△Ct作为待测miRNA的相对表达水平。

1.5 双荧光素酶报告实验通过生物信息学软件Target Scan、miRbase 和miRDB 预测miR-128-3p 靶基因，三款软件均发现ZEB1 的3′-UTR 端与miR-128-3p 有互补结合位点，因此推测ZEB1 为miR-128-3p的靶基因。分别设计合成ZEB1野生型（WT）和突变型（MUT）结合位点序列并克隆至PGL3-Pro-moter 质粒萤火虫荧光素酶下游构建成报告载体。将结直肠癌细胞SW620 以1 × 105个/孔接种在12 孔板中培养，当细胞融合度达80%时，参照转染说明书，将miR-128-3p mimic 或miR-128-3p inhibitor 连同报告载体转染入SW620 细胞，同时转染海肾荧光素酶（phRL-tK）作为内参。转染48 h后，按照Promega 双荧光素酶报告系统试剂盒说明书进行检测。

1.6 WB 实验收集各实验组细胞并用PMSF 及RIPA 提取细胞总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度。取50 μg 蛋白进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5 h，然后将蛋白转移到PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST 洗膜后，加入ZEB1（1∶500）一抗和GAPDH（1∶1 000）一抗，4°C 下孵育过夜，TBST 漂洗后，加入1∶1 000 稀释的羊抗兔二抗37 ℃孵育1 h，将PVDF 膜浸于1 mL 显色液中避光约10 min 后观察结果，用凝胶图像处理系统分析目标条带的相对分子质量和净吸光度值。

1.7 transwell 实验transwell 实验检测细胞迁移：将灭菌Transwell 板下室加入含趋化因子的细胞培养液，各实验组细胞以2×104/mL 浓度接种于含人工基底膜成份的transwell 小室并套入下室，37 ℃培养箱孵育24 h。取出上室，吸取残夜。在下室中添加70%甲醛固定30 min，常规结晶紫染色，在高倍镜视野下计数小室面细胞数即为穿透细胞数。transwell 实验检测细胞侵袭：4 ℃溶解过夜的Matrigel 用无血清RPMI 1640 培养基按1∶7 的体积比例进行稀释后，加20 μL 于transwell 小室中，待Matrigel 凝固后，按照细胞迁移实验进行后续操作。

1.8 统计学方法应用SPSS 17.0 进行统计学分析，计量资料以（）表示，多组间均数差异的比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。采用秩和检验分析miR-128-3p 表达水平与患者临床病理特征的关系。P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-128-3p 在结直肠癌组织和细胞系中低表达qPCR 检测结果显示，miR-128-3p 在结直肠癌组织中的相对表达水平为（0.665±0.030），在癌旁组织中的相对表达水平为（1.493±0.053），两者间差异有统计学意义（t= 13.51，P＜0.001）；miR-128-3p 表达水平与CRC 患者的TNM 分期、淋巴结转移和远处转移显著相关（均P＜0.05），而与患者年龄、性别、肿瘤大小和肿瘤分化程度不具有相关性（均P＞0.05）。miR-128-3p 在SW620、SW480、HT-29、LoVo 细胞中的表达水平显著低于NCM460细胞（均P＜0.05），以SW620细胞中表达水平最低，见图1、表1。

图1 qPCR 检测miR-128-3p 在结直肠癌组织（A）和结直肠癌细胞系（B）中的表达情况Fig.1 The relative expression of miR-128-3p in colorectal cancer tissues（A）and colorectal cancer cell lines（B）was detected by qPCR

表1 miR-128-3p 表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between miR-128-3p expression and clinicopathological characteristics of CRC patients ±s

表1 miR-128-3p 表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between miR-128-3p expression and clinicopathological characteristics of CRC patients ±s

项目性别男 女年龄≤60 岁＞60 岁肿瘤直径≤4 cm＞4 cm TNM 分期Ⅰ-ⅡⅢ-Ⅳ肿瘤分化程度高/中分化低分化淋巴结转移否 是远处转移否 是例数30 26 21 35 24 32 22 34 37 19 30 26 33 23 miR-128-3p expreesion 0.66±0.23 0.67±0.22 0.72±0.22 0.63±0.23 0.64±0.19 0.69±0.25 0.82±0.19 0.57±0.19 0.69±0.23 0.60±0.21 0.79±0.24 0.59±0.19 0.75±0.21 0.54±0.19 t 值0.113 1.411 0.818 4.754 1.464 3.285 3.882 P 值0.910 0.164 0.417＜0.001 0.149 0.002＜0.001

2.2 ZEB1 是miR-128-3p 的靶向调控基因生物信息学 软 件Target Scan、miRbase 和miRDB 均 发现miR-128-3p 在ZEB1 3′-UTR 区有互补结合位点（图2A）。双荧光素酶报告基因实验结果显示（图2B），在WT-ZEB1 3′-UTR 实验中，与mimic-NC 组相比较，miR-128-3p mimics组pGL3-ZEB1的荧光素酶活性显著降低（P=0.027）；与inhibitor-NC组相比较，miR-128-3p inhibitor 组pGL3-ZEB1 的荧光素酶活性显著增高（P= 0.018）。在MUT-ZEB1 3′-UTR实验中，与mimic-NC 组相比较，miR-128-3p mimics组pGL3-ZEB1 的荧光素酶活性差异无统计学意义（P= 0.742）；与inhibitor-NC 组相比较，miR-128-3p inhibitor 组pGL3-ZEB1 的荧光素酶活性差异无统计学意义（P=0.347）。

图2 双荧光素酶报告实验验证ZEB1 与miR-128-3p 的靶向关系Fig.2 The targeting relationship between ZEB1 and miR-128-3p was verified by Luciferase reporter assay

2.3 miR-128-3p 调控结直肠癌细胞SW620 侵袭和迁移Transwell 侵袭实验结果显示（图3A、3C），miR-128-3p mimic 组的侵袭细胞数显著低于mimic-NC组［（89.7±5.6）个vs.（185.6±15.9）个，t=5.688，P= 0.005］，miR-128-3p inhibitor 组的侵袭细胞数显著高于inhibitor-NC组［（308.7±21.3）个vs.（192.3± 16.0）个，t= 4.364，P= 0.012］，而mimic-NC 组与inhibitor-NC 组间侵袭细胞数差异无统计学意义（t= 0.295，P= 0.783）；Transwell 迁移实验结果显示（图3B、3D），miR-128-3p mimic 组的迁移细胞数显著低于mimic-NC 组［（50.3 ± 4.5）个vs.（101.7 ±7.5）个，t= 5.854，P= 0.004］，miR-128-3p inhibitor组的迁移细胞数显著高于inhibitor-NC 组［（193.7± 9.4）个vs.（110.7 ± 6.4）个，t= 7.311，P= 0.002］，而mimic-NC 组与inhibitor-NC 组间迁移细胞数差异无统计学意义（t= 0.911，P= 0.414）。结果表明瞬时上调或下调miR-128-3p 表达可相应抑制或增强结直肠癌细胞SW620 的侵袭和迁移能力。

图3 miR-128-3p 模拟物或抑制物对结直肠癌细胞SW620 侵袭和迁移能力的影响Fig.3 Effects of miR-128-3p mimics or inhibitors on invasion and migration of CRC SW620 cells

2.4 miR-128-3p 通过靶向ZEB1 抑制结直肠癌细胞SW620 侵袭和迁移Transwell 侵袭和迁移实验结果显示（图4A、4B），pcDNA3.1-ZEB1 组的侵袭和迁移细胞数分别为（382.7 ± 15.6）个和（240.3 ±12.9）个，显著高于空白对照组的（167.0 ± 11.0）个和（108.0±10.0）个（t=11.280，P＜0.001；t=8.117，P= 0.001），也显著高于pcDNA3.1-ZEB1+miR-128-3p mimics 组的（219.7 ± 6.8）个和（139.0 ± 6.8）个（t=9.574，P=0.001；t=6.963，P=0.002）。WB 和qPCR 检测结果显示（图4C、4E），pcDNA3.1-ZEB1组ZEB1 蛋白和mRNA 的相对表达水平分别为（0.846 ± 0.053）和（1.633 ± 0.075），显著高于空白对照组的（0.540 ± 0.023）和（1.208 ± 0.022）（t=5.297，P=0.006；t=5.413，P=0.006），也显著高于pcDNA3.1-ZEB1+miR-128-3p mimics 组的（0.569 ±0.044）和（0.890 ± 0.068）（t= 4.042，P= 0.016；t=7.341，P= 0.002）。结果表明转染ZEB1 质粒可上调ZEB1 蛋白表达，促进结直肠癌细胞SW620 的侵袭和迁移，而同时转染miR-128-3p mimics 可下调ZEB1 蛋白和mRNA 的表达，降低ZEB1 对 结直肠癌细胞的侵袭和迁移作用。

图4 miR-128-3p 靶向ZEB1 抑制结直肠癌细胞SW620 侵袭和迁移Fig.4 miR-128-3p targeted ZEB1 to inhibit the invasion and migration of CRC SW620 cells

3 讨论

miRNA是一类小分子非编码RNA，以碱基互补配对的方式与靶基因的3′非翻译区相结合，通过剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译等途径调控靶基因的转录后表达。单一miRNA 可调控数百种靶基因，一种基因也可受多个miRNA调控，以此影响多种信号通路的功能性相互作用参与细胞增殖、细胞凋亡、细胞代谢等多个生理过程。在CRC 发病机制的研究中，目前已发现多种miRNA 异常表达与CRC 进展过程密切相关［9-10］，监测特定miRNA 表达水平可为CRC 的诊断、治疗和预后评估提供帮助，但目前仍有数百种miRNA在CRC 发生发展过程中的功能性作用不清楚，CRC 分子机制仍需进一步探索。近来研究发现，miR-128-3p 在卵巢癌组织和细胞中表达下调并与患者预后相关，miR-128-3p 可靶向调控CDK14 表达抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移［11］；HUO等［12］发现miR-128-3p 通过IRS-1/PI3K/AKT 信号通路靶向神经元正五聚蛋白1（NPTX1）抑制胶质瘤细胞增殖和分化；此外，miR-128-3p 还可靶向转录因子4（TCF4）抑制黑色素瘤A375细胞增殖、侵袭和上皮-间充质转化［13］，以上研究均表明miR-128-3p在肿瘤进展过程中可发挥抑癌基因作用。

在结直肠癌的研究中，LIU 等［14］发现负载miR-128-3p 的纳米复合物通过双靶向抑制PI3K/AKT和MEK/ERK 信号通路的活性，可增强结直肠癌化疗效果；另有研究［15］也指出外泌体传输的miR-128-3p 可增加奥沙利铂耐药结直肠癌细胞的化疗敏感性，但miR-128-3p 在结直肠癌中的表达水平及其与结直肠癌侵袭转移机制的研究目前尚未有报道。本研究通过临床样本检测，发现miR-128-3p在CRC 组织中低表达，且与患者的TNM 分期、淋巴结转移和远处转移有显著相关性，提示miR-128-3p 可能在CRC 中发挥抑癌作用。体外实验进一步发现miR-128-3p 在结直肠癌细胞中呈低表达状态，转染miR-128-3p mimic 或miR-128-3p inhibitor可相应减弱或增强结直肠癌细胞的侵袭迁移能力。为揭示miR-128-3p 对结直肠癌作用机制，我们通过靶基因预测软件和荧光素酶报告实验证实转录因子E 盒结合蛋白1（ZEB1）是miR-128-3p 的下游靶基因，推测miR-128-3p 可能通过靶向调控ZEB1 参与CRC 的侵袭转移。ZEB1 属于ZEB 转录因子家族，可与靶DNA 序列结合并抑制细胞粘附分子以及细胞极性相关基因表达，诱导EMT进程。ZHANG 等［16］研究报道，ZEB1 高表达与结直肠癌肝转移和患者预后不良相关，SÁNCHEZTILLÓ E 等［17］发现ZEB1 通过拮抗uPA 和PAI-1 促进大肠癌细胞侵袭性，我们的研究结果发现ZEB1过表达可促进CRC 细胞的侵袭和迁移，与上述研究报道一致。研究发现甲基化CPG 结合蛋白2（MeCP2）［18］和死亡结构蛋白（DAXX）［19］可通过调控ZEB1 转录促进结直肠癌细胞的侵袭转移，而在食管癌［20］和肺癌［21］的研究中也已报道miR-128-3p靶向调控ZEB1 表达参与了肿瘤侵袭转移机制，以上研究成果提示ZEB1 是肿瘤侵袭转移机制中多信号通路的关键作用点，而miR-128-3p 对ZEB1 的靶向调控很可能在结直肠癌的进展过程中也发挥重要作用。为验证上述推论，将ZEB1 过表达质粒单独转染或联合miR-128-3p mimics 共同转染结直肠癌细胞，并观察其恶性生物学性状的改变。研究结果发现miR-128-3p 对ZEB1 具有靶向调控作用，ZEB1 表达上调可促进CRC 的侵袭迁移，而转染miR-128-3p 可通过下调ZEB1 表达抑制CRC 的侵袭迁移。

综上所述，本研究证实miR-128-3p 与CRC 发生发展有重要关系，其机制是通过调控靶基因ZEB1 的表达而影响CRC 细胞的侵袭和迁移，miR-128-3p 有望作为CRC 潜在的诊断标志物和治疗靶点。