苏格木勒-7对化疗致卵巢功能低下大鼠的卵巢功能保护机制

春莲 吴伟乐斯 布仁巴图

(1内蒙古民族大学附属医院蒙医妇科，内蒙古 通辽 028000；2包头医学院；3内蒙古民族大学附属医院)

苏格木勒-7(苏-7)虽然是传统经典方剂，但目前的研究还处于初级阶段(临床疗效观察及简单的药理作用研究)〔1〕。苏-7药理作用主要是具有抗自由基、抗氧化及提高免疫力等作用〔2〕。而苏-7在治疗卵巢功能低下、保护卵巢功能、延缓卵巢衰老等方面尚无相关研究及报道。本课题组前期研究探索了苏-7对化疗性卵巢功能低下大鼠卵巢的功能保护作用研究，得出苏-7对化疗性卵巢功能低下大鼠的体重、卵巢及脾脏具有保护功能，并能提高免疫力、促进卵巢修复、促进卵泡发育成熟及排卵而恢复性周期，提高繁殖能力及新生鼠的生存率〔3〕。其中以1.0 g/(kg·d)和0.5 g/(kg·d)剂量苏-7 疗效较佳，本研究拟以此剂量做进一步的机制研究。

1 材料与方法

1.1实验动物 10周龄健康 SD 雌性大鼠56只，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。实验动物饲养于内蒙古民族大学附属医院动物实验室。动物实验均遵循动物保护与使用指南，并由内蒙古民族大学动物保护伦理委员会批准。

1.2动物分组 采用56只SD雌性大鼠，体重170～200 g。先适应性喂养7 d后禁食、不禁水10 h；第8天晨测体重并开始取阴道细胞检测性周期，共10 d，剔除无规律性周期和无发情的鼠 8只，剩余48只正常性周期的雌性大鼠按体重排序从随机数字表随机区组法分4组(n=12)，分别为模型组即环磷酰胺组(CTX)、模型加苏格木勒-7〔0.5 g/(kg·d)〕组即苏-7-0.5、模型加苏格木勒-7〔1.0 g/(kg·d)〕组即苏-7-1.0、正常组。

1.3建立模型 除了正常组其他3组均连续7 d腹腔注射CTX 30 mg/(kg·d)，同时每天早上8点对大鼠进行阴道细胞涂片分析，一直到实验结束。发情周期出现紊乱或无发情周期代表模型成功。

1.4药物制备与给药方法 苏-7由内蒙古民族大学附属医院制剂室提供(符合 GPP 标准制剂室)。正常组和模型组等量生理盐水灌胃，其余给药组在造模第1天开始(建模同时)分别灌胃给予苏-7-1.0 g/(kg·d)和苏-7-0.5 g/(kg·d)，每天给药1次，连续给药24 d。

1.5血清及各脏器标本采集 造模7 d+给药24 d后，剩余大鼠于动情间期进行麻醉后打开腹腔，腹主动脉取血，分离血清并送检验室以备酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、转化生长因子(TGF)-β1水平变化。采血后迅速分离左侧卵巢，分为两部分，分装在两个速冻管内迅速置于液氮中，以备-80℃保存，用Western印迹法检测相关蛋白表达；分离右侧卵巢、称重后用10%甲醛固定后送至病理科，做免疫组化法检测相关蛋白的定位及检测表达量。

1.6ELISA检测 血清TGF-β1、IL-6、TNF-α 评估化疗及苏格木勒-7对大鼠卵巢功能保护的机制。

1.7免疫组织化学法 分别对卵巢组织中生长分化因子(GDF)-9和骨形成态蛋白质(BMP)-15、8-羟基脱氧鸟苷(OHdG)、4羟基壬烯醛(HNE)、硝基酪氨酸(NTY)进行定位及表达量评价。

1.8Western印迹检测 Bax、Bcl-2、超氧化物歧化酶(SOD)-2、血小板反应蛋白(TSP)-1、组织蛋白酶(Cathepin)D、骨髓基质细胞抗原(BST)1、补体因子-H(CFH)等蛋白表达量 Bax、Bcl-2是凋亡相关蛋白〔2，3〕；SOD是抗氧化酶〔9〕；其中TSP-1、CathepinD、BST1、CFH是前期临床患者蛋白组学得出的差异蛋白，通过检测大鼠卵巢组织中表达量来进一步验证其结果。

1.9统计学方法 采用SPSS25.0软件行方差齐性检验、单因素方差分析及非参数检验。

2 结 果

2.1苏-7对化疗性卵巢功能低下大鼠TNF-α、IL-6、TGF-β1的影响 与正常组相比，模型组TNF-α、IL-6水平显著增高，TGF-β1水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，苏-7-0.5组TNF-α、IL-6水平显著下降，TGF-β1水平显著增高(P<0.05)，见表1。

表1 各组TNF-α、IL-6、TGF-β1水平比较

2.2Western印迹检测结果 与正常组比较，模型组卵巢内Bax、TSP-1、CFH表达显著增高(P<0.01)，而苏-7-1.0和苏-7-0.5组与模型组相比明显下降(P<0.05，P<0.01)；与正常组比较，模型组Bcl-2、SOD表达水平显著下降(P<0.01)，而苏-7-1.0和苏-7-0.5组与模型组比较显著增加(P<0.05，P<0.01)；其中苏-7-0.5组与苏-7-1.0组相比以苏-7-0.5效果更佳。与正常组比较，模型组CathepinD表达量有所增加，但无显著差异(P>0.05)，治疗后有所下降，但无显著差异(P>0.05)；模型组BST1表达量有所下降，但无显著差异(P>0.05)，治疗后也无升高，反而有降低趋势。见表2。

表2 各组相关蛋白表达量比较

2.3免疫组织化学检测结果 卵巢组织中8-OHdG、4HNE、NTY等氧化应激产物指标及生长因子指标在各组间无统计学意义(P>0.05)。CTX不会导致大鼠卵巢组织氧化应激反应及GDF-9和BMP-15表达量；苏-7可能不通过改善氧化应激及生长因子相关指标起作用。见表3。

表3 免疫组化检测各组相关蛋白表达量比较

3 讨 论

卵巢是女性激素产生的重要器官，对女性的内分泌生殖起非常重要的作用，卵巢损伤引起的卵巢功能下降及卵巢功能提前衰退，将不可避免地导致过早绝经及生殖能力的丧失〔5〕。以往研究〔6～9〕已经证实CTX能引起67%的生育期女性绝经，另外完整的化疗方案后只有0.6%的女性可以怀孕〔10，11〕。卵巢储备功能良好才能有正常的卵巢功能，卵巢储备取决于始基卵泡池的激活与卵泡闭锁的速度〔5〕。本研究逼真的模拟了卵巢功能下降及卵巢早衰，发现苏-7对化疗性卵巢功能低下大鼠卵巢内分泌及生殖功能有改善及保护作用。Bcl-2蛋白家族成员是调节细胞凋亡的重要因子，调控着个体程序性细胞凋亡通路，其中包括抑制细胞凋亡，如Bcl-2和促进细胞凋亡Bax两类功能相反的蛋白质〔12～14〕。Bax是一种重要的促凋亡蛋白，破坏线粒体外膜的完整性而导致促凋亡因子，如细胞色素c的释放及细胞质中凋亡蛋白酶的激活〔15〕。本研究结果表明CTX组卵巢颗粒细胞凋亡明显，苏-7通过对抗卵巢颗粒细胞的凋亡，从而减少卵泡闭锁，增加健康卵泡数目来改善及保护化疗大鼠卵巢功能。

SOD是一个重要的抗氧化酶，本研究结果表明苏-7通过增强大鼠卵巢组织抗氧化能力，抑制细胞凋亡，抑制卵泡提前闭锁，增加健康卵泡数量而起到保护卵巢功能的作用。CTX可能对卵巢组织造成损伤，而TGF-β1表达降低，卵泡不能正常生长发育；低剂量的苏-7可以促进卵巢损伤修复而TGF-β1分泌增高，促进卵泡生长发育，保护卵巢功能。

CFH参与免疫调节及补体激活过程，CFH升高提示组织损伤，本实验结果与免疫相关炎症因子TNF-α及IL-6的检测结果相一致，进一步提示苏-7能抵抗炎症过程，促进组织损伤修复。

TSP-1是一种由衰老细胞产生的多种生物学功能的三聚体糖蛋白，组织器官中TSP-1的升高提示组织损伤的发生。陶潜等〔16〕研究发现，TSP-1是血管抑制因子，TSP-1的表达与卵巢间质微血管密度(MDV)呈负相关。TSP-1高表达可能在卵巢巧克力囊肿卵巢间质微血管网损伤及间质纤维化的发生、发展中起重要作用。本研究结果表明苏-7能保护大鼠卵巢，其机制可能是苏-7通过抑制TSP-1形成；另外有研究报道，TSP-1参与颗粒细胞凋亡〔9〕，本实验结果也证明了TSP-1参与颗粒细胞凋亡这一结果；提示TSP-1可能通过参与卵泡颗粒细胞的凋亡过程，抑制TGF-β1激活，卵巢间质微血管网损伤及间质纤维化的发生等而影响卵泡的正常生长发育及促进卵泡闭锁。而苏-7可能通过降低TSP-1而促进卵巢组织损伤修复，促进卵泡生长发育，抵抗卵泡颗粒细胞的凋亡，减少卵泡闭锁，抑制卵巢间质的纤维化，促进卵巢组织的修复而起到卵巢功能保护作用。

苏-7通过抑制TNF-α、IL-6、CFH水平增高，抑制机体炎症性损伤并保护机体器官功能；通过上调TGF-β1而促进颗粒细胞生长、增殖及促进卵泡发育成熟，增加窦状卵泡数，并促进排卵从而提高大鼠的妊娠率。一方面通过提高SOD表达而提高卵巢组织抗氧化能力，抵抗化疗至卵巢氧化应激状态而抑制卵巢颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁，另一方面通过增加抗凋亡因子，降低促凋亡因子而防止颗粒细胞过早凋亡而抵制卵泡闭锁，从而增加健康卵泡数目来保护化疗大鼠卵巢储备，改善卵巢功能。