Cu(Ⅱ)与4-吡啶甲酸配合物的合成、表征及细胞毒性研究

朱晓鹏， 纪晓茜， 郭海瑞， 高恩军， 朱明昌

(沈阳化工大学 辽宁省无机分子基化学重点实验室， 辽宁 沈阳 110142)

癌症被世界卫生组织列为世界五大疑难杂症之一，目前，中国癌症病发率、死亡率排名全球第一.临床药物顺铂是无机药物创新的一个里程碑式的发现，被广泛用于各种癌症的治疗.但由于铂类药物有抗药性、毒副作用等缺陷，限制了其广泛使用.因此，开发结构新颖、性能更优的无机抗癌药物激发了众多科研工作者的热情[1].针对不同目标采用不同金属，合成安全、可靠、有效和生物相容性的其他金属配合物已成为结构设计、药物治疗和临床应用领域中的发展策略，N-杂环羧酸类配合物因其独特功能性，在药物化学中引起了人们的极大关注[2].

铜是人体的内源金属，相应的铜配合物被证实具有不寻常的电子行为和各种化学反应性，能够与DNA相互作用，并表现出较好的生物氧化还原活性和对核碱基相对较强的亲和力[3-5].据报道，某些铜配合物能够产生大量对线粒体和生物大分子造成氧化损伤的活性氧(ROS)，在无机抗肿瘤领域显示出巨大的潜力.本文合成了一种新的Cu配合物CuL2(H2O)4，初步探讨其对DNA的作用方式及对HeLa癌细胞的作用效果.使用X-射线晶体衍射技术对配合物的结构进行解析，荧光光谱法和凝胶电泳法测定其与DNA作用的方式，荧光显微术测试配合物对HeLa细胞的诱导凋亡.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

4-吡啶甲酸(HL)、三水合硝酸铜(Ⅱ)、PBR322质粒DNA与鱼精DNA(FS-DNA)均是商业来源，无特殊说明的试剂均为AR级产品.

MCO-18AC型二氧化碳培养箱用于HeLa癌细胞(人体宫颈癌细胞)培养；使用Finnigan EA1112型元素分析仪进行碳、氢、氮的元素分析；使用卡尔蔡司公司制造的XD-RFL荧光倒置显微镜进行荧光成像处理；采用Perkin Elmer 公司制造的LS 55型荧光分光光度计检测与鱼精DNA的键合作用.

1.2 配合物的制备

准确称取0.060 0 g Cu(NO3)2·3H2O和0.020 0 g 4-吡啶甲酸，加入12 mLV(DMF)∶V(H2O)=2∶1的溶剂，在40 ℃水浴条件下搅拌反应2 h，调节pH=6后转入15 mL聚四氟乙烯内衬的反应釜中，90 ℃加热反应72 h并缓慢冷却至室温静置24 h.用无水乙醇多次洗涤得到混合物并在空气中干燥，获得适用于X-射线单晶衍射测量的蓝色块状晶体.经元素分析测得[理论值(实测值)，w/%]:C,37.75(37.71)；H,4.75(4.80)；N,7.34(7.39).

1.3 荧光光谱法的测定

溴化乙锭(EtBr)是最强烈的荧光探针之一[6].EtBr是由芳香环组成的共轭平面型分子，其本身的荧光强度非常微弱，但EtBr与无荧光的DNA分子相结合时荧光强度会有显著增强，当EtBr从DNA的双螺旋结构中脱离后荧光强度又会明显下降[7].基于此荧光现象,实验研究了配合物CuL2(H2O)4和EtBr在DNA分子中的置换.通过DNA-EtBr的荧光猝灭程度，即配合物与DNA的亲和力强度监测配合物与鱼精DNA的键合作用.根据经典Stern-Volmer方程I0/I=1+Ksqr描述配合物与DNA的作用强弱.式中：I0、I分别表示配合物CuL2(H2O)4不存在和存在状态下的荧光强度；Ksq是线性Stern-Volmer猝灭常数，该常数取决于EtBr的结合浓度与DNA浓度的比值；r是配合物与DNA的浓度比值.

1.4 琼脂凝胶电泳的测定

琼脂糖凝胶内部孔径较大，因此常用于生物大分子的分离实验.以PBR质粒DNA为靶分子，根据产生DNA形态不同导致在电泳中涌动速度不同，以此检测配合物对DNA的切割能力[8-9].众所周知，应用凝胶电泳监测切割质粒DNA时主要有3种表现形式：如果质粒DNA没有被切割，将看到FormⅠ的超螺旋形式有最快的迁移；如果质粒DNA的一条链被切割，则超螺旋结构将会松弛以产生较慢移动的带切口的圆形形式Form Ⅱ；如果DNA的两条双螺旋链均被切割则会产生中间速率的Form Ⅲ迁移形式[10].凝胶电泳实验使用pH=7.2的Tris缓冲溶液(50.0 mmol/L的Tris乙酸盐，18.0 mmol/L的NaCl缓冲液)和1.5 g琼脂糖制备凝胶，然后用1.0 μL EtBr染色.设置好空白对照组开始加样，在80 V下电泳2 h，置于凝胶图像分析仪中进行拍照，去除背景光.

1.5 荧光倒置显微镜对HeLa细胞的凋亡测定

细胞凋亡主要表现为细胞膜的破裂和细胞核的收缩，凋亡的细胞裂解成凋亡小体后，染色质会冷凝并且伴随DNA的核苷酸链断裂，凋亡小体会被专职或者非专职吞噬细胞吞噬[11-12].目前，诱导细胞凋亡已经成为评价抗癌药物的重要指标.本实验通过配合物和HeLa细胞在37 ℃下孵育12 h，通过PI和FITC染色剂染色，设置波长为560 nm，在40倍镜下观察细胞形态的变化并用荧光显微镜成像.

2 结果与讨论

2.1 配位化合物CuL2(H2O)4的结构与分析

通过X-射线单晶衍射仪对晶体的扫描得出晶体数据及配合物的结构模型(图1)，显示配合物为三斜晶系，空间群为P1，a=0.634 39(11) nm、b=0.689 87(12) nm、c=0.918 38(15) nm、α=99.428(2)°、β=105.241(2)°、γ=108.208(3)°，单晶体积为0.354 86(10) nm3.

由图1可知:中心金属Cu的配位数为6，其中金属铜(Ⅱ)与2个4-吡啶甲酸的氮原子相连，且和4个水分子中的氧相连.2个吡啶环彼此平行，2个氮原子和铜原子牢牢相连使之无法扭曲从而形成一个平面，形成了一个完全对称的配合物.Cu—O(3)键长为1.976 nm，Cu—O(5)键长为1.999 nm，Cu—O(6)键长为2.457 nm，Cu—N(1)键长为2.023 nm，Cu—N(4)键长为1.983 nm， O(3)—Cu—N(4)键角为91.0°，O(3)—Cu—O(5)键角为178.9°，N(4)—Cu—O(5)键角为90.0°，O(3)—Cu—N(1)键角为89.8°，N(4)—Cu—N(1)键角为178.4°，O(5)—Cu—N(1)键角为89.2°.

图1 Cu配合物的结构

2.2 荧光光谱分析

以526 nm为荧光光谱的激发波长，测得DNA-EtBr复合物体系[c(DNA)=5×105mol/L,c(EtBr)=2.54×10-4mol/L]与不同浓度的配合物CuL2(H2O)4作用的发射谱图(其中荧光发射峰为618 nm)如图2所示.

1 c(配合物)=0.00 mol/L 2 c(配合物)=0.50 mol/L 3 c(配合物)=1.00 mol/L 4 c(配合物)=1.50 mol/L 5 c(配合物)=2.00 mol/L 6 c(配合物)=2.50 mol/L 7 c(配合物)=3.00 mol/L

由图2曲线的变化可知：使用溴化乙锭处理DNA得到DNA-EtBr复合物后，随着加入配合物CuL2(H2O)4的浓度加大，DNA-EtBr复合物体系荧光猝灭程度越来越明显，加入配合物CuL2(H2O)4达到3.00 mol/L时，荧光猝灭程度达到最大，荧光猝灭现象的发生说明配合物CuL2(H2O)4与鱼精DNA发生了键合作用.

根据Stern-Volmer方程I0/I=1+Ksqr计算作图，如图3所示，配合物的Ksq值为0.061.数据结果表明配合物CuL2(H2O)4与EtBr发生了竞争作用，使DNA-EtBr体系的荧光强度得以猝灭.

图3 配合物Stern-Volmer猝灭曲线

2.3 琼脂凝胶电泳实验

电泳2 h后，置于凝胶图像分析仪中拍照，去除背景光后得到如图4所示图像.

图4 配合物切割PBR322 DNA

从图4可以看到：质粒DNA可被铜配合物有效切割，将FormⅠ超螺旋DNA降解为FormⅡ开环DNA及较少的FormⅢ线性DNA，其中0为空白组，1、2、3道为添加5.5 μmol/L、2.75 μmol/L、1.375 μmol/L浓度梯度呈下降的铜配合物.随着配合物浓度的降低其切割DNA的活性呈下降趋势，这一规律与荧光光谱法测量所得到的结果相一致.

2.4 荧光显微分析

细胞凋亡是常见的基因控制过程.细胞凋亡成像技术通过细胞形态的变化观测凋亡情况，图像的方法可直观地研究细胞形态学.经过配合物作用HeLa细胞12 h后，用FITC和PI染色.使用荧光倒置显微镜对HeLa细胞进行观测，发现细胞核质发生明显浓缩，核膜发生破损，这些结果表明配合物可有效诱导HeLa癌细胞发生凋亡，如图5所示.

图5 配合物诱导HeLa细胞凋亡效果

3 结 论

实验制备了一种新的过渡金属配合物CuL2(H2O)4，并对其性质进行了表征.X-射线单晶衍射对配合物结构进行了分析；荧光光谱分析说明配合物与DNA发生了键合作用；琼脂凝胶电泳实验进一步验证了该配合物与DNA有较强的切割活性；荧光显微镜分析则显示了该配合物可有效诱导HeLa癌细胞的凋亡，产生抗肿瘤效果.一系列实验结果表明配合物CuL2(H2O)4具有较好的生物学性质，可用于进一步研究，是一种有前景的抗肿瘤功能分子材料.