加味六味地黄汤对大鼠肾间质纤维化的干预机制

黄仁发， 梁群卿， 李贺生， 杨义龙， 黄家晟， 陈鹏辉， 杨朔， 吴金玉

（1.广州中医药大学深圳医院（福田）肾病科，广东深圳 518034；2.广西中医药大学附属瑞康医院健康体检中心，广西南宁 530011；3.广西中医药大学第一附属医院肾内科，广西南宁 530023）

我们的前期临床研究表明，加味六味地黄汤（又名怡肾汤）能减少慢性肾衰竭患者蛋白尿，改善肾功能，调节免疫功能[1]；肾纤维化是慢性肾脏病进展到终末期肾衰竭的共同路径，动物实验研究表明，该方能改善单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction）大鼠肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis），保护肾功能，其机制可能与阻断Wnt4/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的活化，下调纤维生长因子23（FGF-23）的表达有关[2]。Wnt/β-catenin是进化上高度保守的信号通路，其生物学作用广泛，参与细胞增生、分化、凋亡、三维组织器官的形成、生长发育等过程[3]。经典的Wnt/β-catenin信号通路主要由细胞外因子Wnt蛋白、β-catenin、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、结肠腺瘤性息肉蛋白（APC）、核内转录因子T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）等信号分子组成[4]。其中，Wnt4蛋白主要表达于泌尿生殖系统，对泌尿生殖系统发育至关重要[5]。近年来的研究表明，纤维连接蛋白（Fn）、原癌基因c-myc不仅参与了细胞外基质的积聚形成，而且还是Wnt4/β-catenin信号通路靶基因，Wnt4/β-catenin信号通路活化后可通过调控Fn和c-myc表达增多参与肾间质纤维化过程[6]。本研究中，我们进一步观察单侧输尿管梗阻大鼠肾组织Wnt4/β-catenin信号分子磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）、磷酸化LEF/TCF（p-LEF/TCF）以及Fn和c-myc的表达变化以及加味六味地黄汤的干预作用，以明确加味六味地黄汤抗肾间质纤维化新的作用机制和靶点，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物120只清洁级健康10~12周龄雄性SD（Sprasue-Dawley）大鼠，体质量（210±34）g，购自上海斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证号：SCXK（湘）2013-0004。在广西中医药大学实验动物学部按标准条件饲养，室内温度为18~22℃，每天保证12 h照明，并每日定时清洗笼舍，保证实验大鼠能自由摄食、饮水。

1.2 实验药物及制备加味六味地黄汤由熟地黄10 g、山茱萸10 g、干山药15 g、泽泻10 g、茯苓12 g、丹皮10 g、黄芪30 g、桂枝10 g、大黄10 g、丹参15 g组成。以上中药材均购自广西中医药大学附属瑞康医院药剂科。将以上中药材浸泡2 h后，急火煮沸，再微火煎煮至少30 min。每剂药煎熬2次，置于容器，混匀浓缩为含生药1 g/mL的药液，-20℃冰箱保存备用。

1.3 试剂小鼠源性Wnt4多克隆抗体、小鼠源性β-catenin多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；小鼠源性p-GSK-3β多克隆抗体（美国Abcam公司）；小鼠源性p-TCF/LEF多克隆抗体、小鼠源性Fn多克隆抗体、小鼠源性c-myc多克隆抗体（北京博奥森生物公司）；SP免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；蛋白提取试剂盒（上海申能博彩生物技术公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、苯甲基磺酰氟（PMSF）（江苏碧云天生物技术公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（苏州广惠科技有限公司）。

1.4 仪器生物光学显微镜、RM2125型石蜡切片机、UCT型超薄切片机、H1650R型台式高速冷冻离心机、SPECTRA max Plus 384酶标仪（美国Molecular Devices公司）；ChemiDoc XRS+System凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.5 分组、造模与给药将120只大鼠随机分为假手术组、模型组、中药组、缬沙坦组等4组，每组30只，然后各组组内再分成7、14、28 d等3个时间点，每个时间点10只大鼠。除假手术组，其他组别大鼠均构建单侧输尿管梗阻模型。单侧输尿管梗阻大鼠模型是经典的肾间质纤维化模型，造模方法按照本课题组前期研究[6]报道的步骤进行。步骤简述如下：用100 g/L的水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，从左肋下钝性分离暴露左肾，左侧输尿管上段行双线（4号丝线）结扎并在两结扎点间剪断输尿管。假手术组除不结扎输尿管外其他手术步骤均与上述造模方法相同。术后24 h，中药组即开始给予加味六味地黄汤2.376 g·kg-1·d-1（2 mL/d）灌胃，缬沙坦组给予缬沙坦30 mg·kg-1·d-1（2 mL/d）灌胃，同时，假手术组和模型组均给予生理盐水2 mL/d灌胃，每日1次，直至相应实验时间点处死。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测大鼠肾组织Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-TCF/LEF蛋白的表达取备检的大鼠肾组织剪成碎片，加入蛋白裂解液提取总蛋白，用BCA定量试剂盒检测蛋白浓度。电泳，转膜，封闭，Wnt4多克隆抗体（1∶100稀释）孵育，二抗孵育。用IPP图像分析软件测量蛋白条带的光密度（OD）值，以β-actin蛋白为内参照，计算OD目的蛋白/ODβ-actin比值作为目的蛋白的表达量。β-catenin多克隆抗体（1∶200稀释）、p-GSK-3β多克隆抗体（1∶200稀释）、p-TCF/LEF多克隆抗体（1∶200稀释）、β-actin多克隆抗体（1∶3 000稀释）的检测步骤同前。

1.6.2 免疫组织化学法检测大鼠肾组织c-myc、Fn蛋白的表达将肾组织切片常规脱蜡至水，用体积分数3%H2O2阻断灭活内源性过氧化物酶，0.01 mol/L枸橼酸缓冲液煮沸修复抗原，羊血清工作液封闭，滴加c-myc多克隆抗体（1∶150稀释），4℃过夜，滴加二抗37℃孵育30 min，二氨基联苯胺（DAB）显色5～20 min。显微镜（200~400倍）下观察大鼠肾组织蛋白表达的量及部位，肾小管上皮细胞胞浆有棕黄色颗粒为阳性，不着色者为阴性，测量阳性表达蛋白的OD值。Fn多克隆抗体（1∶150稀释）的检测步骤同前。

1.7 统计方法采用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。若方差齐性，多组比较采用单因素方差分析，组间比较用LSD法进行多重比较；如方差不齐，则用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-TCF/LEF表达比较图1和表1结果显示：假手术组大鼠肾组织可见少量Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-LEF/TCF蛋白表达，模型组大鼠第7天肾组织即可见明显的Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-LEF/TCF表达，至14 d达高峰。与假手术组相同时间点比较，模型组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-LEF/TCF表达量明显上调，差异均有统计学意义（P<0.01）；与模型组相同时间点比较，中药组和缬沙坦组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-TCF/LEF蛋白表达量明显下调，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），且中药组与缬沙坦组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-TCF/LEF蛋白相对表达量比较Table 1 Comparison of the relative protein expression levels of Wnt4，β-catenin，p-GSK-3β，p-TCF/LEF in kidney tissue of various groups （±s）

表1 各组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-TCF/LEF蛋白相对表达量比较Table 1 Comparison of the relative protein expression levels of Wnt4，β-catenin，p-GSK-3β，p-TCF/LEF in kidney tissue of various groups （±s）

①P<0.01，与假手术组相同时间点比较；②P<0.05，③P<0.01，与模型组相同时间点比较

组别假手术组模型组中药组缬沙坦组p-TCF/LEF蛋白相对表达量0.06±0.02 0.18±0.12①0.72±0.22①0.32±0.13①0.08±0.04③0.43±0.12③0.18±0.09②0.09±0.05③0.41±0.13③0.22±0.11②时间点（d）14 7 14 28 7 14 28 7 14 28鼠数（只）10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Wnt4蛋白相对表达量0.25±0.11 0.52±0.12①1.36±0.38①1.07±0.24①0.26±0.10③1.03±0.22②0.78±0.12②0.21±0.09③0.94±0.25②0.69±0.16③β-catenin蛋白相对表达量0.22±0.09 0.52±0.12①1.18±0.41①0.65±0.14①0.24±0.08③0.85±0.18③0.67±0.35 0.18±0.10 0.83±0.31③0.16±0.05③p-GSK-3β蛋白相对表达量0.07±0.03 0.18±0.06①1.14±0.36①0.31±0.02①0.08±0.02③0.32±0.11③0.15±0.08③0.07±0.01③0.25±0.12③0.09±0.03③

2.2 各组大鼠肾组织c-myc、Fn蛋白表达比较图2、图3和表2结果显示：假手术组大鼠肾组织可见少量c-myc、Fn蛋白分布；模型组大鼠第7天肾小管间质胞浆即可见明显的c-myc、Fn蛋白分布，表达水平高于假手术组（P<0.05或P<0.01），至14 d达高峰；中药组和缬沙坦组肾小管间质c-myc、Fn蛋白分布面积减少，表达水平低于模型组（P<0.05或P<0.01）。

图2 各组大鼠肾组织c-myc蛋白表达分布比较（免疫组织化学法，×200）Figure 2 Comparison of distribution of c-myc expression in kidney tissue of various groups（by immunohistochemical method，×200）

表2 各组大鼠肾组织c-myc、Fn蛋白表达水平比较Table 2 Comparison of the protein expression levels of c-myc and Fn in kidney tissue of various groups（±s）

表2 各组大鼠肾组织c-myc、Fn蛋白表达水平比较Table 2 Comparison of the protein expression levels of c-myc and Fn in kidney tissue of various groups（±s）

①P<0.01，与假手术组相同时间点比较；②P<0.05，③P<0.01，与模型组相同时间点比较

Fn OD值0.11±0.04 0.12±0.05 0.13±0.03 0.26±0.13①0.64±0.21①0.53±0.14①0.16±0.04③0.50±0.13②0.39±0.11②0.15±0.07②0.47±0.12②0.36±0.09②组别假手术组模型组中药组缬沙坦组时间点（d）7 14 28 7 14 28 7 14 28 7 14 28鼠数（只）10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 c-myc OD值0.12±0.03 0.13±0.04 0.15±0.05 0.29±0.11①0.76±0.23①0.54±0.17①0.17±0.08③0.55±0.16②0.42±0.14②0.19±0.10②0.48±0.13②0.38±0.11②

图3 各组大鼠肾组织Fn表达分布比较（免疫组织化学法，×200）Figure 3 Comparison of distribution of Fn expression in kidney tissue of various groups（by immunohistochemical method，×200）

3 讨论

Wnt/β-catenin是一重要的高度保守细胞信号通路，其生理作用广泛，涉及细胞的增生、分化、细胞命运的决定、组织器官的生长发育等。Wnt和β-catenin是该信号通路的核心分子，无Wnt信号刺激时，β-catenin可与轴蛋白（axin）/APC/GSK-3β形成β-catenin降解复合体，结合游离的β-catenin并使其泛素化，使得胞浆内的β-catenin维持在比较低的水平。一旦有Wnt与细胞膜上受体Frizzled及辅助受体与辅助受体-低密度脂蛋白受体相关蛋5/6（LRP5/6）结合，GSK-3β磷酸化，将信号从胞外传至胞浆内，使β-catenin降解复合体解离，游离的β-catenin增多，并转位至细胞核与LEF/TCF相互作用，TCF/LEF发生磷酸化，促进下游靶基因Fn、c-myc的转录增多，参与一系列生理病理反应[7-8]。最近的研究表明，Wnt/β-catenin信号通路参与了肾纤维化过程。有研究[9]发现，高糖可诱导人类肾小管上皮细胞（HK2）的Wnt/β-catenin信号通路活化，同时平滑肌动蛋白（β-smooth muscle actin，α-SMA）表达增多，E钙黏素表达减少，而Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK-1可以逆转这种改变，提示Wnt/β-catenin信号通路活化参与了糖尿病肾病肾小管上皮-肌成纤维转分化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）过程。而研究[10]发现，单侧输尿管梗阻大鼠肾间质的Wnt/β-catenin信号通路活化，可通过促使巨噬细胞M2型极化参与肾间质纤维化过程。

本研究结果发现，假手术组大鼠肾组织仅存在少量的Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-LEF/TCF表达，而单侧输尿管梗阻大鼠第7天即开始出现肾组织Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-LEF/TCF明显的表达上调，第14天达到高峰，表明单侧输尿管梗阻可诱导大鼠肾间质经典Wnt4/β-catenin信号途径活化，促使其下游的信号分子GSK-3β和LEF/TCF磷酸化增强，参与了促肾间质纤维化的发生和发展，这与Abbas和Sun等学者的研究[11-12]一致。前已述及，Fn、c-myc是Wnt4/β-catenin信号途径下游的靶基因。Fn是细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）的重要组成部分，它们的过度沉积是肾间质纤维化形成的最基本病理改变[13]。而c-myc是原癌基因，主要功能为促进细胞的增殖，在正常肾组织仅有低表达，单侧输尿管梗阻大鼠模型肾组织可见c-myc明显增加，参与肾纤维化的形成和发展[14]。本研究结果发现，假手术组大鼠肾组织仅存在少量Fn、c-myc表达，而单侧输尿管梗阻大鼠肾组织Fn、c-myc的表达明显上调，并且其高峰时间与Wnt4/β-catenin信号通路活化一致，均为14 d，提示Wnt4/β-catenin信号通路活化导致下游的致纤维化因子Fn、c-myc转录增多，参与了肾间质纤维化的过程。

目前中医学认为，肾间质纤维化的病因病机为本虚标实，本虚为脾肾两虚，标实为水湿瘀毒，病理改变具有“虚、瘀、湿、毒”的特点。我们根据单味药研究的结果，在六味地黄汤的基础上加入桂枝、大黄、黄芪、丹参，取桂枝通阳利水湿、大黄通便以排毒、黄芪益气健脾利水、丹参活血化瘀，取名加味六味地黄汤，全方共奏补肾、利水活血、排毒的功能[6]。既往我们的研究[6]结果已证实，加味六味地黄汤能够降低单侧输尿管梗阻大鼠尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）酶、尿素氮（BUN）和血清肌酐（SCr）水平，改善肾纤维化，加味六味地黄汤具有较强的抗肾间质纤维化的作用。本研究中，我们进一步探讨了加味六味地黄汤对肾间质纤维化Wnt4/β-catenin信号分子（磷酸化GSK-3β、LEF/TCF）以及Fn和c-myc表达的影响。本研究结果发现，加味六味地黄汤干预后，单侧输尿管梗阻大鼠肾组织Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-TCF/LEF、Fn和c-myc蛋白的表达水平均显著下调，表明加味六味地黄汤可阻断大鼠肾间质纤维化Wnt/β-catenin信号的活化，抑制下游信号分子GSK-3β和TCF/LEF的磷酸化，继而减少了下游靶基因Fn和c-myc的转录，提示这可能是加味六味地黄汤新的抗肾间质纤维化机制。

综上所述，加味六味地黄汤可能通过阻断Wnt4/β-catenin信号通路的活化，下调Fn和c-myc蛋白的表达，发挥抗肾间质纤维化的作用。