益肾安胶囊活血化瘀作用研究

赵云丽，张若松，罗晓东，郭 枫，张翔华，尚建华

(1.中国科学院昆明植物研究所 植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，云南 昆明 650201；2.中国科学院大学，北京100049；3.云南大学 教育部自然资源药物化学重点实验室 云南省天然产物转化与应用重点实验室，云南 昆明 650091；4 .昆明肾脏病研究所，云南 昆明 650031)

血液的高凝状态在肾小球肾炎的发病环节中起着不可忽视的重要作用.近年来，用活血化瘀中药治疗慢性肾炎取得了一定疗效.本研究采用大鼠寒凝血瘀症和小鼠实验性微循环障碍模型，考察与评价益肾安胶囊的活血化瘀作用，为临床应用提供实验依据.

1 实验材料

1.1 受试药物

益肾安胶囊，0.35 g/粒，4粒/次，3次/d，由昆明肾脏病研究所提供, 批号070501；实验采用胶囊内容物，为棕褐色粉末，常温密闭保存.阿魏酸哌嗪片，国药准字H43021825，50 mg/片，湖南千金湘江药业股份有限公司出品.肾复康胶囊，国药准字Z22024866，0.30 g/粒，4～6粒/次，3次/d，通化茂祥制药有限公司出品.

1.2 试剂

盐酸肾上腺素注射液，国药准字H41021054，1 mg/mL，天津药业集团新郑股份有限公司，批号060901；戊巴比妥钠，进口分装，25 g/瓶，上海化学试剂采购供应站经销.肝素钠，效价 150 u/mg，北京奥博星生物技术责任有限公司.枸橼酸三钠，分析纯，500 g/瓶，天津市化学试剂三厂.血凝测定试剂盒：PT、TT、APTT、FIB，均购自上海太阳生物技术有限公司出品.二磷酸腺苷(ADP)，0.5 g/瓶，上海伯奥生物科技有限公司.乌拉坦(化学纯)，北京化学试剂公司.

1.3 仪器

F5810-R台式高速冷冻离心机，德国eppendorf公司；MVIS全自动血液流变仪，重庆天海；LBX-NJ血液凝聚仪，北京普利生仪器有限公司；C2000-4高性能血凝仪，北京普利生仪器有限公司；WX-6微循环显微仪，重庆天海.

1.4 动物

3～4月龄SPF级SD大鼠70只，雌雄各半，体重250～350 g；3～4周龄SPF级ICR小鼠，雌雄兼用，体重18～21 g；由昆明医学院实验动物中心提供；生产许可证：SCXK(滇)2005-0008，发证机关：云南省科学技术厅.饲养于IVC动物实验室，温度20～25 ℃(日温差≤3 ℃)，湿度40%～70%，照明 12 h∶12 h 明暗交替，照度150～300 lx，噪音≤60 dB；实验动物使用许可证：SYXK(滇)2005-0001，发证机关：云南省科学技术厅.

2 实验方法

2.1 对大鼠寒凝血瘀症模型的影响

SD大鼠70只，雌雄各半，按性别和体重随机分为7组：空白对照组；模型对照组；阳性对照阿魏酸哌嗪片 0.1 g/kg 组；中药对照肾复康胶囊 1.28 g/kg 组(相当于临床用量的14.3倍)；益肾安胶囊0.5、1.0、2.0 g/kg；每组10只.各组动物每日按剂量灌胃给药1次，连续 10 d，给药容量均为 10 mL/kg，空白和模型对照组灌服等容量纯水.

参照文献方法[1-2]，各组动物第 9 d 给药后 1 h，除空白对照外，其余各组均皮下注射盐酸肾上腺素 0.8 mg/kg，2 d 后将动物浸入7～8 ℃ 的冰水中置留 5 min，间隔 2 h 再以相同剂量二次皮下注射肾上腺素.造模动物次日给药后 1 h，以 40 mg/kg 剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，颈动脉插管取血，分别注入肝素钠和枸橼酸钠的抗凝管内，置于旋涡震荡器上混匀后，分别用于血液流变学、血小板活性及凝血指标测定[3].

肝素抗凝管用MVIS血液流变仪测定全血粘度后，以 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液测定血浆粘度.枸橼酸钠抗凝管以 1 000 r/min 离心 10 min 制备富血小板血浆(PRP)，剩余部分按 3 000 r/min 离心 10 min 制备贫血小板血浆(PPP)，用LBX-NJ血液凝聚仪按比浊法测定ADP-2Na诱导的血小板聚集率，ADP的终浓度为 3 μmol/L；用C2000-4高性能血凝仪按试剂盒方法分别测定TT、PT、APTT及FIB.

2.2 对小鼠微循环障碍模型的影响

参照文献[4]稍作改进，取18～22 g 小鼠80只，雌雄各半，按性别和体重随机分为8组：空白对照；模型对照；阳性对照阿魏酸哌嗪片 0.1 g/kg；中药对照肾复康胶囊 0.9 g/kg；益肾安胶囊0.35、0.7、1.4、2.8 g/kg；每组10只.各组动物每日分别按剂量灌胃给药一次，连续 3 d，容积均为 20 mL/kg，空白和模型对照组给予同体积的纯水.末次给药后 30 min，以12%的乌拉坦溶液按 10 mL/kg 的剂量腹腔注射麻醉动物，固定耳廓，置于放大100倍的微循环显微仪下，以合适的毛细血管(动、静脉平行，为第3级分支)为观察对象，按 0.5 mg/kg 的剂量给小鼠腹腔注射盐酸肾上腺素造成实验性微循环障碍模型.分别采集造型前和造型后5、10、20、30 min 的图像，测定以下3个指标：①微动脉管径(A3)；②微静脉管径(V3)；③毛细血管网计数，观察并记录各项指标的变化情况.

2.3 统计学处理

3 实验结果

3.1 益肾安调节寒凝血瘀症模型大鼠全血粘度

由表1可见，模型组动物全血粘度明显升高，与空白对照组相比差异有极显著性意义(P<0.01)，表明实验造模成功；与模型对照组相比，阳性对照阿魏酸哌嗪片和益肾安胶囊中、低剂量组，均可明显降低血瘀症大鼠不同切变率下的全血粘度(P<0.05/0.01)；阳性对照肾复康胶囊及益肾安胶囊高剂量组，对全血粘度亦有降低趋势，但无统计学差异.

表1 对血瘀症大鼠全血粘度的影响

3.2 益肾安降低血浆粘度、RBC聚集指数和电泳时间

由表2可见，与空白对照组相比，模型组动物血浆粘度明显升高(P<0.01)、RBC电泳时间明显延长(P<0.01)、RBC聚集指数有增加趋势(P>0.05)，表明实验造模成功.与模型对照组相比，阳性对照阿魏酸哌嗪片和肾复康胶囊及益肾安胶囊中、低剂量组，对血浆粘度均有降低趋势，但无统计学差异；阿魏酸哌嗪片和益肾安胶囊三剂量组，对红细胞聚集指数有降低趋势(P>0.05)；益肾安胶囊中剂量组能明显缩短红细胞电泳时间(P<0.05)，但阳性对照阿魏酸哌嗪和肾复康胶囊仅有作用趋势(P>0.05).

表2 对血瘀症大鼠血浆粘度、RBC聚集指数和电泳时间的影响

3.3 益肾安下调血小板聚集率

由表3可见，模型组动物血小板聚集率明显增高，与空白对照组相比差异有极显著性意义(P<0.01)，表明寒凝血瘀状态可致血小板聚集性增加；与模型对照组相比，中药对照肾复康胶囊和益肾安胶囊高剂量组，可明显降低高凝状态下的血小板聚集率(P<0.05/0.01)；肾安胶囊中、低剂量和阳性对照阿魏酸哌嗪组仅有降低趋势，但无统计学差异.

3.4 益肾安改善凝血指标

由表4可见，与空白对照组相比，模型组PT、APTT、TT有缩短趋势(P>0.05)，FIB明显增加(P<0.01)；与模型对照组相比，中药对照肾复康胶囊和益肾安胶囊中、高剂量组，对APTT和TT有延长趋势(P>0.05)；阳性对照阿魏酸哌嗪和益肾安胶囊低剂量组对FIB有降低趋势(P>0.05)；其余给药组对其他指标无明显影响.

表3 对寒凝血瘀症大鼠血小扳聚集率的影响

表4 对血瘀症大鼠凝血指标的影响

3.5 益肾安增加微循环障碍小鼠血液循环

由表5～7可见，小鼠腹腔注射 0.5 mg/kg.bw 盐酸肾上腺素，可使耳廓微动脉和微静脉管径明显收缩(P<0.01)、毛细血管网开放数呈减少趋势(P>0.05)，表明实验性微循环障碍造模成功；阳性对照阿魏酸哌嗪片和肾复康胶囊、益肾安胶囊4个剂量组，均可明显对抗肾上腺素所致微循环障碍模型动物的微动脉和微静脉收缩(P<0.05/0.01)；除中药对照肾复康胶囊能明显增加模型动物的毛细血管网开放数(P<0.05)外，阿魏酸哌嗪片和益肾安胶囊各剂量组仅有作用趋势，但无统计学差异.

表5 对微循环障碍小鼠耳廓微动脉管径的影响

表6 对微循环障碍小鼠耳廓微静脉管径的影响

表7 对微循环障碍小鼠耳廓毛细血管网开放数的影响

4 结语

中医认为慢性肾小球肾炎时，各种致病因素极易导致痰湿、瘀血阻滞肾络，肾络不通，肾脏衰败[5].肾络瘀阻是贯穿慢性肾炎始终的基本病机，同时也是导致慢性肾炎发展和加重的根本病机.慢性肾炎病程长，“久病必瘀”“ 久病入络为瘀血”[6].瘀血既是病理产物，又是致病因素.肾病可以导致瘀血形成，瘀血可以使肾病加重或缠绵难愈.

现代研究表明，在慢性肾小球肾炎的整个发病过程中，机体内普遍存在着凝血机制的紊乱而处于高凝状态、微循环障碍、血液流变学异常等，且对病变持续发展和肾功能进行性衰退具有重要意义.血液黏度增高可进一步促使血管内血栓形成，引起全身或局部循环和微循环障碍，加重对肾小球的损害[7].

益肾安胶囊以0.5、1.0、2.0 g/kg 的剂量连续灌胃给药 10 d，中、低剂量组能明显降低寒凝血瘀症大鼠的全血粘度，高剂量组可明显抑制由ADP诱导的血小板聚集；以0.35、0.7、1.4、2.8 g/kg 的剂量连续灌胃给药 3 d，均能明显对抗肾上腺素致微循环障碍模型小鼠的微动脉和微静脉血管的收缩，对毛细血管开放数有增加趋势.提示，益肾安胶囊可通过降低血液粘度、抑制血小板集聚、改善微循环的途径，降低血液的高凝状态，达到活血化瘀的目的.