医用高分子材料表面机械抗菌研究进展

张传忠，肖晴，单长丽

（菏泽家政职业学院，山东 菏泽 274000）

医用高分子材料在医疗器械领域有着十分重要的地位，这类材料在导尿管[1]、口腔预防用防龋材料、合理控制菌群生态防止微生物对牙面侵蚀[2]、中心静脉导管[3]等都有着重要的应用，是生物材料中最重要的材料之一，其广阔的应用前景与巨大的发展潜力使其备受研究人员和医疗器械制造公司的欢迎。在实际手术前后，医疗器械携菌、术后染菌会诱发灾难性感染，给患者带来极大的生理痛苦和经济压力。细菌黏附于医疗器械表面的初始阶段，可快速增殖形成一层致密生物膜，一旦生物膜开始形成，抑制细菌增殖将变得相当困难。高分子医疗器械表面大多数不具有杀菌作用，因此，抗细菌吸附、抗生物膜形成，是医用高分子材料表面改性的主要方向[4]。

现存抗菌材料的抗感染途径主要包括了抗细菌黏附、接触杀菌及药物释放杀菌、机械杀菌4 类。机械杀菌是利用材料表面特殊拓扑结构实现抗菌效果，最具代表性的材料为黑硅，其表面具有类似蜻蜓翅膀微观结构的仿生针状纳米结构，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有强的杀伤作用[5]。抗黏附涂层和接触杀菌涂层主要是通过化学接枝手段实现长链高分子聚合物（如聚乙二醇等）或抗菌物质（如季铵盐等）的材料表面固定化。抗黏附涂层在抑制细菌黏附的同时也可能影响损伤修复细胞的黏附，通常表现为有一定的细胞毒性。释放杀菌材料主要是通过在医疗器械表面制备构建具有金属离子或杀菌物质缓释功能的涂层[6-7]。该类材料是目前临床应用的最多的。银纳米颗粒和金属氧化物纳米颗粒分别通过释放出银离子和生成活性氧（ROS）有效地杀死细菌，是目前应用最广泛的两种无机纳米抗菌剂[8-9]。

每当抗生素应用于生物膜，其杀灭细菌的功效仅限于生物膜的顶层，对位于微生物群体内的细菌几乎没有影响。抗生素在整个生物膜中渗透并发挥其作用的这种能力不足可能使细菌产生抗生素耐药性，这是使用抗生素对抗生物膜失败的主要原因之一[10-13]。目前，每年世界各地70 万人死于抗生素耐药性感染，如果不改善这一状况，这一数字将在2050年增加到惊人的1 000 万。

如果在初始阶段可以在医疗器械表面上防止细菌黏附和生长，则可以抑制细菌生物膜的形成。有一些研究不是通过化学方法杀死细菌，而是通过细菌与材料表面接触而杀灭细菌。这些研究大部分是受到自然的启发，其中已知的几种昆虫翅膀或皮肤具有杀死与其接触的微生物的杀菌表面。这些表面的杀菌作用是由于存在尖锐的纳米结构（纳米柱形状，直径 50～250 nm，高度 80～250 nm，间距100～250 nm），在接触或破裂细菌时刺入细菌细胞壁，从而杀死细菌。这种机械杀菌方法已经成为一种解决细菌耐药性的有效途径[14-16]。

1 细菌细胞壁分类

细菌细胞壁是一种多层结构，可为细菌提供强度、刚度和形状，并保护细菌免受渗透破裂和机械损伤，机械杀菌的机制就是破坏细菌细胞壁的过程。根据其结构、组分和功能，细菌细胞壁可分为两大类：革兰氏阴性和革兰氏阳性。革兰氏阴性细胞壁是由外膜和一层7～8 nm 的肽聚糖组成，外膜和肽聚糖通过脂蛋白连接，肽聚糖又位于外膜和细胞质膜之间的周质内。外膜含有一种可以穿过膜的、亲水的小分子孔蛋白以及延伸到细胞外空间的脂多糖（LPS）分子。外膜中的这些成分对于革兰氏阴性细菌的结构完整性和活力是必不可少的。革兰氏阳性细胞壁含有一层厚的30～100 nmPG 层（比革兰氏阴性细菌厚4～5 倍），它其中含有磷壁酸和脂磷壁酸，磷壁酸附着并嵌入PG 层中，而脂磷壁酸延伸到细胞质膜中[17]。

2 医用高分子材料表面改性后杀菌效果

有研究表明，使用纳米压印光刻来制作聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）表面的仿生纳米柱后并接种大肠杆菌，相较于在平坦的PMMA 表面上大肠杆菌呈形态正常的棒状，在拥有纳米柱的结构上，当细菌伸展在几根柱子上时，细菌出现了萎缩，柱子上不规则的（块状）细菌表明细胞已经破裂，膨胀压力已经消失。柱状表面与平面相比具有较低的黏附细菌密度（平膜上67%～91%的密度）。此外，黏附的大部分大肠杆菌死于柱状表面（死亡部分比平膜上高16%～141%）。研究还指出，较小间距的纳米柱具有更好的杀菌性能[18-19]。最小间距且最小的纳米柱与平面对照相比，在24 h 内将细菌水性悬浮液中的负荷降低了50%。通过对细胞取向数据的定量分析，确定最佳纳米柱间距的最小阈值在130～380 nm 之间。细菌细胞长度的测量也表明纳米柱对大肠杆菌形态产生不利影响。总之，这项工作表明，具有精确尺寸的几何形状的印迹聚合物纳米结构可以在不进行任何化学修饰的情况下杀死细菌。

具有抗反射和疏水性能的功能性聚合物膜已广泛用于电子器件显示器。然而，这种功能膜的抗菌特性的设计一直是一个挑战。有的研究者[20-21]使用严格的耦合波分析纳米压印设计出的纳米结构表面，以在平坦的聚（甲基丙烯酸甲酯）膜上制备了纳米结构，该结构不仅疏水，并且表现出所需的光学特性，在可见波长范围内反射率小于0.5%。此外，与相应的平坦表面相比，纳米压印聚合物表面显示出抗菌特性和低黏附性。结果表明，在该研究中设计的纳米结构表面是多功能的并且应该适合于用于便携式电子设备的显示器的保护性光学和卫生聚合物膜的生产。

有研究者使用直接激光干涉图案（DLIP）来修改亚微米级的聚苯乙烯表面形貌。结果表明，三维微米结构对细菌黏附产生明显的影响。因此，线状和柱状图案增强了金黄色葡萄球菌的黏附，而复杂的薄片微观形貌在静态和连续流动培养条件下减少了金黄色葡萄球菌的黏附[22]。

然而，因为关于表面微观形貌对细菌黏附的影响的知识仍然很大程度上是经验性的，所以有必要通过实验测试每种模式以确定其在体外和体内条件下的行为。规则的线状和柱状图案增强了金黄色葡萄球菌的黏附，而不规则的LA 微观形貌减少了静态和连续流动培养条件下的黏附。此外，薄片状纹理表面在人血清蛋白存在下抑制金黄色葡萄球菌黏附，并且当材料皮下植入异物相关感染模型时，表明由薄片状纹理组成的PS 表面可能提供有希望的策略减少金黄色葡萄球菌对生物医学表面的黏附。有趣的是，当表面涂有人血清蛋白时，以及当材料皮下植入异物相关感染模型时，薄片状纹理表面保留了抑制金黄色葡萄球菌黏附的能力。正在进行的研究有必要证明其他聚合物（如聚酰亚胺和聚对苯二甲酸乙二醇酯）表面的薄片微观形貌也能抑制金黄色葡萄球菌的黏附[23]。

3 纳米结构表面的机械特性对其杀菌功效的影响

从这些模型和相关的实验研究中可以看出，纳米结构表面的杀菌活性取决于几个参数，例如纳米结构的尺寸、形状和间隔/密度。这些结果表明，可以通过纳米结构的密度和直径来调节杀菌效率。然而，他们没有解释具有较小直径和较高密度的较高杀伤效率背后的潜在机制。细菌和纳米结构表面之间的黏附强度是纳米结构中的重要元素，诱导细胞破裂。细菌细胞壁和表面之间的较大黏附力导致给定纳米结构几何形状破裂的可能性很高。细菌与纳米结构表面的黏附取决于表面的疏水性/亲水性和细胞膜组成。当受到纳米结构表面的挑战时，细菌将通过增加与多个锚定点的接触面积来尝试沉积在纳米结构表面上。在该拉伸过程中，当细胞壁达到作用于其上的应变的阈值极限时，细胞壁破裂可以发生。如果存在于表面上的纳米结构是柔韧的，则它们可能弯曲并且更难以获得拉伸的细胞壁破裂的阈值应变。因此，这种柔韧性可能使细菌使纳米结构变形，使得微生物可以在“钉床”上沉降和增殖。

4 细菌与纳米结构表面相互作用机械模型

图1（A）为棒状细胞和蝉翼表面之间的模型相互作用的三维图。当细胞（a1）接触并且（a2）吸附在细胞上时纳米柱，（a3）外层开始在柱子之间的区域破裂复制。图1（B）为粘附于a 的细菌细胞的示意图（b1）平面和（b2）细菌细胞粘附在蝉翼状纳米图案表面（L和R分别代表细菌的长度和半径，h是纳米柱的高度，Rp 是纳米柱的半径）。图1（C）为吸附在两个相邻纳米柱上的细菌膜的侧视示意图，其中H是纳米级的高度，2R是纳米级的底部宽度，SA表示覆盖该部分的细菌膜部分的接触区域，SB表示悬浮膜的面积，r0是从分界线到X轴的距离，D是两个相邻纳米柱之间的距离。图1（D）（d1）以六边形排列的纳米柱附着在表面上的细菌膜的顶视图，横截面图和放大图（Rp 是纳米柱的半径，Dp 是纳米柱之间的距离，L和R代表纳米图案表面上细菌的长度和半径，h是变形深度和θ细菌细胞膜与图案化表面的接触角）；（d2）细菌膜在半径空间与纳米柱间距拉伸时的相图（颜色条表示细菌膜拉伸程度的值，红色对应高值，蓝色对应低值）[24]。

图1 细菌与表面改性后高分子相互作用的模型示意图

POGODIN 等开发了一个生物机械模型来解释纳米蝉翼和细菌之间的相互作用，考虑细菌细胞壁的两个部分：与纳米柱接触的区域和悬浮在纳米柱之间的区域（图1A）。假定细菌细胞为薄的弹性层，因为蝉翼上的纳米柱（100 nm）的尺寸比细胞壁的厚度（10 nm）大一个数量级并且细菌表面与纳米柱之间的曲率被忽略。由于蝉翼上存在机械纳米结构形貌，细菌膜通过增强相互作用的表面积而吸附在多个纳米柱上，这导致不均匀的拉伸而使膜破裂。LI[25]等通过考虑细菌细胞（长度L和半径R）的自由能变化，研究了纳米结构表面（图1B 中的高度h和半径Rp）的杀菌机理和定量热力学模型，在细菌细胞壁于平坦表面和纳米结构表面的相互作用中显示了差异。细菌细胞与平坦表面和纳米结构表面的相互作用之间的主要对比是黏附区域中黏附和细胞膜变形的接触区域。与平坦表面相比，纳米结构表面增强的杀菌效率归因于接触黏附总面积的增加（参见图1B（b2）），其增强了膜的拉伸应变，当拉伸足够时导致细胞裂解。因此可以通过增加表面粗糙度以及纳米结构的半径和高度来促进杀菌率。在类似于蝉翼的模型中，薛等假设在与纳米柱接触的区域中细菌膜的变形以及悬挂在纳米柱之间的细菌膜的变形的抛物线轮廓（图1C），这与POGODIN等的研究不同他们忽略了悬在纳米柱之间的细菌膜的曲率，考虑了重力和范德瓦尔力在破裂细胞壁中的组合作用，并且显示出纳米蝉翼面可以非常高效地杀死革兰氏阴性细菌[26]。还提出通过具有大间距的尖锐纳米特征可以增强杀菌效率，这与KELLEHER 等的发现相反，他们建议采用更紧密的纳米结构以提高杀灭效率。LI 等考虑了细胞-纳米结构表面黏附能量与细胞膜变形能之间的平衡（图1D（d1））。他们认为，由于表面粗糙度引起的接触面积增加，黏附能量可以增强，同时半径小的纳米柱也可以增加变形能量，设计了相图（颜色条表示细菌膜的拉伸程度的值，红色对应于高值（增强阶段）和蓝色低值（抑制阶段）），用于解释纳米柱半径和细菌在纳米结构表面上黏附的间距（图1D（d2））的相关的影响。

5 结束语

抗菌素耐药性已成为一项紧迫的全球挑战，需要智能替代解决方案来应对细菌感染。细菌的形状、大小、细胞壁厚度、外膜组成和其他特征不同。尽管已经在不同的纳米结构形态上证明了机械杀灭细菌，但是没有明确的通用指南适用于所有细菌和具有不同物理和化学性质的所有底物。不同的模型优先考虑不同的节距：较低弯曲能量模型首选的节距、更高的节距优选通过基于拉伸的模型。事实上，太高的螺距可能导致支柱之间的细菌生长。似乎纳米纹理需要一定的最小纵横比，否则细胞将能够“感知”其拓扑结构。在尺寸、形状、纵横比和密度方面找到优化的纳米形貌，这应该针对不同大小和类型的细菌进行调整，仍然是一项重大的科学挑战。