红花黄色素对心肌细胞H9C2的保护研究

刘广雁，肖梦媛，陈建英

【关键字】红花黄色素；心肌细胞H9C2；氧化应激；超氧化物歧化酶2；髓过氧化物酶；过氧化氢酶；谷胱甘肽过氧化物酶4

心肌缺血/再灌注损伤（IRI）是心脏手术期间心肌损伤的主要原因，尤其是在冠状动脉（冠脉）搭桥术中[1]。缺血性心肌的再灌注增加了活性氧（ROS）的产生，随后诱导了氧化应激，有助于心脏IRI[2]。目前证明抑制心肌细胞中ROS的产生可以减弱心肌的IRI[3]。研究表明[4]，红花黄色素具有缓解心肌缺血的作用。关于红花黄色素发挥生物学功能的机制尚不明确。红花黄色素的缓解心肌缺血作用是否和氧化应激相关值得探索。microRNA（miRNA）是小RNA分子，通过与靶mRNA结合而在基因沉默和翻译抑制中发挥作用[5]。目前有多种药物是通过调节miRNA的表达来间接影响目的基因表达的方式来达到治疗的目的[6]。因此，红花黄色素可能是通过调节miRNA的方式来缓解心肌缺血。基于此，本研究使用心肌细胞H9C2为研究对象旨在探讨红花黄色素调控缺氧/复氧后心肌细胞对H9C2氧化应激的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料心肌细胞H9C2购自procell公司（货号：CL-0089）。胎牛血清购自广州市左克生物科技发展有限公司（货号：HQ30071）。第一链cDNA合成试剂盒购自北京兰博利德商贸有限公司（货号：C1802）。青链霉素混合液（100×）购自上海亿言生物科技有限公司（货号：SL6040-100 ml）。hsa-miR-224-3p，hsa-miR-6891-5p，hsa-miR-382-5p，hsamiR-3689c，hsa-miR-3907，hsa-miR-4694-3p，hsa-miR-639，hsa-miR-451b，hsa-miR-5579-5p，hsa-miR-4297，hsa-miR-4795-3p，hsa-miR-761，hsa-miR-877-3p，hsa-miR-3173-3p，hsa-miR-4666b，hsa-miR-522-3p，hsa-miR-5683，hsa-miR-6780a-5p，hsa-miR-6827-5p，hsa-miR-30c-1-3p，hsa-miR-5581-5p，hsa-miR-183-5p，hsa-miR-1273h-5p，hsa-miR-887-5p，hsa-miR-30b-3p，hsa-miR-6779-5p，hsa-miR-6788-5p，hsa-miR-3689b-3p，hsa-miR-3689a-3p，hsa-miR-30c-2-3p的mimics和qPCR引物均有北京擎科合成。H9c2（2-1）细胞专用培养基购自procell公司（货号：CM-0089）。BCA蛋白定量试剂盒购自北京迈瑞达科技有限公司（货号：M052460-500T）。转染试剂购自广州一科生物科技有限公司（货号：BB-4601-2）。pEZX-MT01购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心（货号：pEZXMT01）。MDAELISA试剂盒购自昆明皇宝商贸有限公司[货号：ml027131-48T（JK）]。SODELISA试剂盒购自北京金优科技有限公司（货号：F6483-A）。CATELISA试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司（货号：KA2310）。GSH-Px ELISA试剂盒购自上海机纯实业有限公司（货号：ml026404）。荧光素酶标记试剂盒购自广州一科生物科技有限公司（货号：A1001-8）。红花黄色素购自广州威佳科技有限公司（货号：030-10672）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染心肌细胞H9C2使用H9c2（2-1）细胞专用培养基，放在37℃、5%CO2的培养箱中孵育。将hsa-miR-224-3p，hsamiR-6891-5p，hsa-miR-382-5p，hsa-miR-3689c，hsa-miR-3907，hsa-miR-4694-3p，hsa-miR-639，hsa-miR-451b，hsa-miR-5579-5p，hsa-miR-4297，hsa-miR-4795-3p，hsamiR-761，hsa-miR-877-3p，hsa-miR-3173-3p，hsa-miR-4666b，hsa-miR-522-3p，hsamiR-5683，hsa-miR-6780a-5p，hsa-miR-6827-5p，hsa-miR-30c-1-3p，hsa-miR-5581-5p，hsa-miR-183-5p，hsa-miR-1273h-5p，hsa-miR-887-5p，hsa-miR-30b-3p，hsa-miR-6779-5p，hsa-miR-6788-5p，hsa-miR-3689b-3p，hsamiR-3689a-3p，hsa-miR-30c-2-3p的mimicshsamiR-224-3p，hsa-miR-6891-5p，hsa-miR-382-5p，hsa-miR-3689c，hsa-miR-3907，hsa-miR-4694-3p，hsa-miR-639，hsa-miR-451b，hsamiR-5579-5p，hsa-miR-4297，hsa-miR-4795-3p，hsa-miR-761，hsa-miR-877-3p，hsa-miR-3173-3p，hsa-miR-4666b，hsa-miR-522-3p，hsa-miR-5683，hsa-miR-6780a-5p，hsa-miR-6827-5p，hsa-miR-30c-1-3p，hsa-miR-5581-5p，hsa-miR-183-5p，hsa-miR-1273h-5p，hsamiR-887-5p，hsa-miR-30b-3p，hsa-miR-6779-5p，hsa-miR-6788-5p，hsa-miR-3689b-3p，hsa-miR-3689a-3p，hsa-miR-30c-2-3p的mimics与转染试剂1:3的比例混合后，室温静置15 min，缓慢滴入心肌细胞H9C2中。红花黄色素的处理浓度为10 mM，溶于PBS中。

1.2.2 RNA抽取与实时荧光定量PCR通过RNA抽取试剂盒抽取食管癌细胞CaES-17的总RNA。使用第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。采用qRTPCR检测髓过氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）、超氧化物歧化酶3（SOD3）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）、谷胱甘肽过氧化物酶2（GPX2）、谷胱甘肽过氧化物酶3（GPX3）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）mRNA的表达。qRTPCR反应为95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸34 s。该工艺共40个循环，以GAPDH为内参照。

1.2.3 酶联免疫吸附实验收集不同处理方式的心肌细胞H9C2的上清或裂解液，根据ELISA试剂盒的说明书检测心肌细胞H9C2中MDA，SOD，CAT，GSH-Px的浓度。总蛋白定量使用BCA定量试剂盒。

1.2.4 RNA-seq通过trizol法抽取红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2的总RNA、红花黄色素未处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2的总RNA。RNA样品被送到北京基因组研究所（中国深圳）进行商业性RNA-Seq服务和数据分析。使用SOAPaligner/SOAP2不匹配，将明确的读段映射到human数据库。计算每个基因的纯净读数，将其标准化为每百万分之一读数（kbKM），该读数将读数与基因表达水平相关。利用log2比率来确定基因调控。选择log2比率为-1或log2比率为1的学差异基因进一步分析。

1.2.5 荧光素酶报告实验荧光素酶报告质粒pEZX-MT01包含MPO、SOD2、CAT、GPX4的野生型或突变型3'UTR。使用荧光素酶报告基因系统分析荧光素酶活性前，将hsa-miR-887-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-639、hsa-miR-761或阴性对照（NC）和荧光素酶报告基因共转染至心肌细胞H9C2（1×104）48 h。

1.3 统计学分析所有数据采用SPSS 18.0进行处理。数据以均数±标准差表示，统计学比较采用双尾t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红花黄色素对缺氧/复氧后心肌细胞对H9C2氧化应激的影响对心肌细胞H9C2进行缺氧/复氧处理后，发现MDA的水平上升（P＜0.05），SOD、CAT、GSH-Px的水平下降（P＜0.05），图1。使用红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2后，发现MDA的水平下降（P＜0.05），SOD、CAT、GSH-Px的水平上升（P＜0.05），图2。

图1 缺氧/复氧后心肌细胞H9C2对氧化应激的影响（与对照组比较，aP＜0.05）

图2 红花黄色素对缺氧/复氧后心肌细胞H9C2氧化应激的影响（与对照组比较，aP＜0.05）

2.2 红花黄色素对缺氧/复氧后心肌细胞H9C2氧化应激关键基因的影响使用红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2后，与未处理的缺氧/复氧后心肌细胞H9C2比较，发现氧化应激关键基因MPO的表达水平下降（P＜0.05），SOD2、CAT、GPX4的表达水平上升（P＜0.05），SOD1、SOD3、GPX1、GPX2、GPX3的表达水平无明显变化（P＞0.05），图3。

图3 红花黄色素对缺氧/复氧后心肌细胞H9C2氧化应激关键基因的影响（与对照组比较，aP＜0.05）

2.3 红花黄色素调控缺氧/复氧后心肌细胞H9C2的miRNA表达使用红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2后，与未处理的缺氧/复氧后心肌细胞H9C2相比，有19中miRNA表达下调，11中miRNA表达上调，图4。

图4 红花黄色素调控缺氧/复氧后心肌细胞H9C2的miRNA表达

2.4 红花黄色素调控缺氧/复氧后心肌细胞H9C2氧化应激的关键miRNA将11种表达上调的miRNA进行过表达，发现过表达hsa-miR-887-5p时MPO的表达水平下降（P＜0.05），将19种表达下调的miRNA进行过表达，发现过表达hsa-miR-382-5p时SOD2的表达水平下降（P＜0.05）、过表达hsa-miR-639时CAT2的表达水平下降（P＜0.05）、过表达hsa-miR-761时GPX4的表达水平下降（P＜0.05），图5。通过荧光素酶报告实验发现hsa-miR-382-5p靶向SOD2的3端非编码区（P＜0.05），hsa-miR-887-5p靶向MPO的3端非编码区（P＜0.05），hsamiR-639靶向CAT的3端非编码区（P＜0.05），hsa-miR-761靶向GPX4的2的3端非编码区（P＜0.05），图6。

图5 miRNA过表达对SOD2、MPO、CAT、GPX4表达的影响（与对照组比较，aP＜0.05）

图6 荧光素酶报告实验分析靶向SOD2、MPO、CAT、GPX4的miRNA（与对照组比较，aP＜0.05）

3 讨论

红花黄色素是中药红花的主要成分，具有促进血液循环和祛瘀作用[6]。现代药理研究表明，红花黄色素具有多种功能，包括抗肿瘤，抗炎，抗氧化，神经保护和激活血液循环[7]。

本研究发现红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2后，发现MDA水平下降，SOD、CAT、GSH-Px水平上升。研究表明[8]，红花黄色素增加了心肌血氧供应，减少心肌细胞凋亡。在缺氧条件下，线粒体中的有氧呼吸可能受到氧气供应的限制，电子传输成分进一步减少，且在配合物Ⅲ和Ⅳ处越来越多地产生超氧化物和NO，引发一系列其他ROS和RNS的形成[9]。红花黄色素与常规治疗相结合是治疗稳定型心绞痛的一种极具成本效益的疗法，它具有促进血液循环，抑制血瘀和减轻疼痛的作用[10]。红花黄色素在缓解手术中局部缺血和缺氧中起到重要作用。

红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2后，与未处理的缺氧/复氧后心肌细胞H9C2相比，氧化应激关键基因MPO的表达水平下降（P＜0.05），SOD2、CAT、GPX4的表达水平上升，SOD1、SOD3、GPX1、GPX2、GPX3的表达水平无明显变化。提示MPO、SOD2、CAT、GPX4可能在缺氧/复氧后心肌细胞中表达失常，而红花黄色素则逆转了这种失调。红花黄色素处理缺氧/复氧后心肌细胞H9C2后，与未处理的缺氧/复氧后心肌细胞H9C2相比，有19中miRNA表达下调，11中miRNA表达上调。将11种表达上调的miRNA进行过表达，过表达hsa-miR-887-5p时MPO的表达水平下降，将19种表达下调的miRNA进行过表达，过表达hsa-miR-382-5p时SOD2的表达水平下降、过表达hsa-miR-639时CAT2的表达水平下降、过表达hsa-miR-761时GPX4的表达水平下降。此外，荧光素酶报告实验发现hsamiR-382-5p靶向SOD2的3端非编码区，hsa-miR-887-5p靶向MPO的3端非编码区，hsa-miR-639靶向CAT的3端非编码区，hsa-miR-761靶向GPX4的2的3端非编码区。HO2-或OH氧化多不饱和脂肪酸会导致脂质过氧化物的形成，酶或化学降解会导致MDA生成[11]。MDA的毒性在于它能够与巯基和蛋白质的氨基（赖氨酸和组氨酸）形成迈克尔加成物，或易于与交联生物大分子，如结构和功能蛋白及核酸，影响了几种细胞过程[12]。SOD是内在的抗氧化酶的普遍存在的家族，可催化超氧化物阴离子的歧化[13]。研究表明[14]，SOD通过减少脂质过氧化物和超氧阴离子的产生，在细胞抵抗IRI的过程中起着重要作用，而破坏小鼠SOD相关基因会使心脏容易受到感染。IRI细胞内SOD活性的降低会增加内皮细胞对ROS诱导的H2O2-损伤的敏感性[15]。因此，增加细胞SOD活性可以抑制ROS的过量产生，保护心脏免受IRI侵害。CAT在细胞抗氧化剂防御中起重要作用，且主要集中在过氧化物酶体中[16]。CAT通过细胞穿透肽或通过逆转录病毒介导的过程进行转导，可恢复低过氧化氢酶个体细胞中的酶水平，中和活性氧并降低人类原发性角质形成细胞中炎性细胞因子的表达，并延迟了成纤维细胞中老化标记的出现。此外，心肌细胞中增加CAT的能保护心室肌细胞免受IRI损伤[17]。GPX4基因编码的蛋白质属于谷胱甘肽过氧化物酶家族，其成员催化谷胱甘肽还原有机氢过氧化物和过氧化氢，保护细胞免受氧化损伤[18]。通过限制H2O2的积累，GPX4可能参与调节此过程。

综上，红花黄色素通过调控hsa-miR-382-5p、hsa-miR-887-5p、hsa-miR-639、hsamiR-761的表达水平，分别靶向SOD2、MPO、CAT、GPX4mRNA的3端非编码区，之后调控其表达水平，最终调节缺氧/复氧后心肌细胞H9C2的氧化应激。