沙库巴曲缬沙坦对缺血性心力衰竭兔心室肌重构的影响

张飞飞，宋学莲，谢悦陶，刘立天，苑可心，郝清卿，党懿

心力衰竭（心衰，HF）是导致死亡的主要原因之一，研究表明终末期心衰患者1年的存活率仅50%。心肌梗死伴有心肌细胞坏死、心肌组织顿抑、机械性并发症、心肌瘢痕形成及心室肌重构等，导致心功能的失代偿，最终进展为心衰[1]。随着急性心肌梗死发病率的升高，心肌梗死（心梗）后导致的心脏收缩和（或）舒张功能障碍，已成为目前心衰的主要原因。其治疗历经了从纠正血流动力学异常到以神经内分泌抑制剂为基础的生物治疗，但死亡率较高、预后较差[2]。沙库巴曲缬沙坦（LCZ696）一种是血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂（ARNI），可阻滞血管紧张素Ⅱ受体和抑制脑啡肽酶，降低激素水平，抑制细胞肥大，发挥扩张血管、利钠、利尿、改善心肌重构作用[3-5]。沙库巴曲缬沙坦对于缺血性心衰心肌重构的影响及具体机制仍需进一步研究。本研究通过建立心肌梗死后兔心衰动物模型并给予沙库巴曲缬沙坦干预，通过观察及测定其心脏超声、心肌组织病理、羟脯氨酸含量、α-平滑肌肌动蛋白及半乳糖凝集素3蛋白表达，探讨沙库巴曲缬沙坦对缺血性心衰心室肌重构的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物选用6月龄新西兰大白兔24只为实验对象，体重2.5～3.5 kg，由河北医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（冀）2016-002。均饲养于与河北省人民医院临研中心动物房，室温条件下分笼饲养。

1.2 主要试剂和仪器戊巴比妥钠，生理盐水，青霉素钠，液氮，4%多聚甲醛，沙库巴曲缬沙坦（LCZ696）100 mg/片购自北京诺华制药有限公司，兔N末端脑钠肽前体（NT-proBNP）试剂盒购自武汉科鹿生物科技有限公司，羟脯氨酸（HYP）试剂盒购自南京建成生物科技公司，抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体、抗半乳糖凝集素3（Gal-3）抗体均购自河北博海生物工程开发有限公司。二抗为生物素标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。IU22彩色超声诊断仪（Philips公司，荷兰；探头为S5-1，Mhz），光学显微镜（BX53，Olympus公司，日本）等。

1.3 实验分组及心衰模型建立实验动物术前随机分为三组：假手术组，心衰组、沙库巴曲缬沙坦组，每组各8只。心衰组及沙库巴曲缬沙坦组实验动物以3%戊巴比妥钠溶液经（1 ml/kg）耳缘静脉麻醉，于胸骨左缘4、5肋间区开胸，暴露心脏，打开心包膜，充分暴露前降支，采用6-0线穿过心肌浅层结扎前降支中上1/3处。心电图2个相邻导联ST段显著抬高。肉眼见前降支供血区的心肌颜色变为暗紫色，搏动减弱。逐层关胸，术后给予青霉素160万U肌肉注射3 d防感染。术后2周行超声心动图检查，以射血分数（EF）≤40%视为心衰模型制作成功。

1.4 实验干预术后3周，沙库巴曲缬沙坦组满足心衰标准的实验动物给予沙库巴曲缬沙坦，以10 mg/kg·d灌胃，干预8周。假手术组及心衰组实验动物给予生理盐水灌胃8周。

1.5 超声心动图检测分别于实验第2周末和10周末对各组实验动物行彩色超声心动图检查，使用IU22彩色超声诊断仪，在M-型图像上测定左室收缩末内径（LVESD）、左室舒张末内径（LVEDD）、左室缩短率（LVFS）和左室射血分数（LVEF）。以上各测量值均取连续3次测量的平均值。

1.6 ELISA法检测兔血清NT-proBNP水平于实验第2周末、10周末经耳缘静脉取血约5 ml，以3000 r/min离心10 min，取血清应用ELISA法测定各组NT-proBNP水平。

1.7 HE染色、Masson染色实验第10周末完成心脏超声测定后，处死实验动物，留取心梗边缘处心肌组织于4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，生物切片机切取5 μm厚组织切片，行常规HE染色、Masson染色，于光镜下观察心肌组织病理形态及纤维化。Masson染色中胶原纤维等被染成蓝色，应用Image Pluse 6.0软件分析检测心肌组织胶原容积分数（CVF），CVF为心肌纤维化面积与心肌总面积比值。

1.8 心肌组织HYP测定称取心梗边缘处心肌组织30 mg，加1 ml水溶解液，沸水浴水解20 min，加入适量活性炭充分混匀，3500 r/min离心10 min，水浴15 min，再次离心10 min后取上清液测定波长550 nm的吸光度（A）值。HYP含量（μg/mg）=（测定A值-空白A值）/（标准A值-空白A值）×标准品滴度×水解液总体积/组织重量。

1.9 免疫组化观察心肌组织α-SMA、Gal-3水平心肌组织切片经二甲苯脱蜡，各级乙醇至水洗，3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，并用山羊血清37℃封闭20 min，封闭后分别加入抗α-SMA、Gal-3抗体（1:50）4℃孵育过夜，滴加二抗，37℃孵育20 min，DAB显色。显色后呈棕黄色颗粒为阳性反应。苏木素染核，脱水封片。应用Image Pluse 6.0软件分析图像。

1.10 统计学方法运用SPSS 22.0统计软件分析。计量数据均采用均值±标准差（±s）表示，组间均数比较采用方差分析及SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组动物一般情况24只新西兰大白兔中，假手术组实验动物全部存活，心衰组及沙库巴曲缬沙坦组中均有1只动物因术中出血死亡。术后2周，心衰组及沙库巴曲缬沙坦组中各存活7只且均满足心衰标准，沙库巴曲缬沙坦组实验动物接受8周药物治疗。

2.2 各组动物心脏超声测定结果心梗后心衰模型建立后2周，与假手术组相比，心衰组、沙库巴曲缬沙坦组LVESD，LVEDD扩大，LVEF，LVFS明显下降（P＜0.05），术后10周，与心衰组相比，沙库巴曲缬沙坦组的LVESD、LVEDD、LVEF指标明显改善（P＜0.05），表1。

表1 实验第2周、10周各组动物心脏超声测定结果

2.3 各组动物模型NT-proBNP检测结果实验第2周末，与假手术组相比，心衰组、沙库巴曲缬沙坦组血浆NT-proBNP水平明显升高（P＜0.05）。实验第10周末，与心衰组相比，沙库巴曲缬沙坦组的血浆NT-proBNP水平下降，但仍高于假手术组（P＜0.05），表2。

表2 实验第2周、10周各组动物血清NT-proBNP测定结果

2.4 各组心梗边缘心肌组织病理检查及羟脯氨酸检测结果HE染色示假手术组心肌纤维排列有序，细胞形态一致，胞质染色均匀。心衰组心肌组织肌纤维排列紊乱、肌细胞呈现不同程度变性、坏死及淋巴细胞浸润。沙库巴曲缬沙坦心肌组织的表现较心衰组改善。Masson染色示胶原纤维呈绿色，肌纤维和纤维素呈红色。Masson染色示与假手术组相比，心衰组心肌组织胶原纤维含量明显增加[45%（3.74） vs. 23.62%（3.5），P＜0.05]，与心衰组相比，沙库巴曲缬沙坦组心肌组织的胶原纤维沉积明显下降[45%（3.74） vs. 34.42%（1.71），P＜0.05]；心衰组心肌组织羟脯氨酸含量增加，与假手术组相比差异有统计学意义[0.97（0.04） vs. 0.42（0.02）μg/mg]，P＜0.05；沙库巴曲缬沙坦组心肌组织中羟脯氨酸含量下降，与心衰组心肌组织相比，差异有统计学意义[0.97（0.04） vs. 0.69（0.01）μg/mg]，P＜0.05，图1。

图1 各组心肌组织病理检查及羟脯氨酸检测结果

2.5 各组心肌中α-SMA、Gal-3免疫组化结果α-SMA及Gal-3蛋白阳性表达产物呈棕黄色颗粒。与假手术组相比，心衰组心肌组织中α-SMA及Gal-3蛋白阳性表达产物增加[（30.51±2.37） vs.（61.28±3.14）]%，[（38.25±3.24） vs.（62.42±1.71）]%，均有统计学差异（P＜0.05）；沙库巴曲缬沙坦可下调心衰心肌组织中α-SMA及Gal-3蛋白阳性表达产物[（61.28±3.14） vs.（48.85±4.41）]%，[（62.42±1.71） vs.（51.42±2.76）]%，均有统计学差异（P＜0.05），图2。

图2 各组心肌中α-SMA、Gal-3蛋白的免疫组化测定结果

3 讨论

随着医疗技术水平改进，急性心肌梗死的死亡率较前下降，但梗死后继发的心室重构已成为导致心衰的主要原因。心肌重构的是由血液动力学与神经内分泌共同介导，引起心肌细胞肥大、变形、坏死、凋亡及胶原纤维分泌增加，心肌纤维化及瘢痕形成，心室壁肥厚或变薄、顺应性减低，心室腔形态改变，导致心功能从代偿转变为失代偿，最终表现为心力衰竭[6,7]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RASS）的激活在心肌梗死后心室重构发挥重要作用，其可影响心肌细胞蛋白合成和细胞凋亡，通过细胞因子激活成纤维细胞且促使胶原纤维的合成增加，作用于基质金属蛋白，影响细胞外基质降解。利钠肽系统可抑制RASS的激活，改善心室重构及纤维化，且具有扩张血管及利钠、利尿作用[8-10]。沙库巴曲缬沙坦在抑制RASS的同时还可抑制内啡肽酶，PARADIGM-HF研究中缺血性HFrEF患者达60%，研究结果显示与依那普利相比，沙库巴曲缬沙坦可显著降低心血管死亡风险及再次住院率[11]。后续研究发现沙库巴曲缬沙坦可改善心衰患者NTproBNP、LVEF、LVEDD[12-14]。本研究通过结扎前降支成功建立缺血性心衰动物模型，依据既往研究结果中新西兰兔给予10 mg/kg分沙库巴曲缬沙坦可平衡RASS与利钠肽系统为基础给予相应的干预[15]，结果与既往相一致，8周的沙库巴曲缬沙坦治疗可改善缺血性心衰兔心脏超声的LVESD、LVEDD、LVEF，并下调NT-proBNP水平，改善缺血性心力衰竭兔的心功能。

Ryan等研究发现沙库巴曲缬沙坦可抑制大鼠心肌成纤维细胞，改善后负荷增加引起的心肌纤维化[1]。Torrado等建立缺血再灌注及心梗后HF兔模型，分别于缺血开始时及心衰模型建立后给予沙库巴曲缬沙坦干预，结果显示其早期即可发挥降低心梗面积保留LVEF作用，且提升心衰模型的LFVE，减少梗死心肌的面积，改善心肌重构[15]，但未对胶原纤维影响进行探讨。本研究与既往结果相一致，HE染色显示沙库巴曲缬沙坦可改善心衰心肌纤维的排列，降低心肌细胞的变形、坏死及炎性细胞浸润程度。胶原纤维蛋白沉积增加是评价心肌纤维化的重要指标，HYP在胶原纤维所占比例恒定，依据羟脯氨酸的含量可评估心肌组织中胶原纤维含量，本研究中Masson染色提示心衰心肌胶原纤维的增生，分布于心肌纤维束间，呈网状分布，CVF、HYP含量明显增加，沙库巴曲缬沙坦可降低缺血性心衰兔心肌CVF、HYP含量，改善心肌纤维化程度。

成纤维细胞是正常心肌组织中胶原纤维的主要分泌细胞，在心肌损伤、前后负荷增加等病理状态下成纤维细胞增生并转化为肌成纤维细胞，其合成细胞外基质的能力明显提升，对心肌组织纤维化起重要作用，α-SMA是区别肌成纤维细胞与纤维细胞的主要分子[16]。本研究采用免疫组化技术显示心衰心肌组织中α-SMA表达明显增加，而沙库巴曲缬沙坦可抑制其表达，提示沙库巴曲缬沙坦通过抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转变途径，发挥改善心肌重构作用。Gal-3是一种可溶性β半乳糖苷结合蛋白，对于心衰预测具备较高的特异性[17]。前期研究显示心衰小鼠心肌组织中Gal-3表达水平增加，对于正常小鼠给予Gal-3干预后心肌胶原纤维含量增加，基质金属蛋白酶及其抑制物失衡，表现出心脏结构改变及心功能不全，提示其通过促进心肌成纤维细胞增殖、胶原纤维沉积导致心肌重构[18]。临床证实Gal-3可作为急性心衰短期预后的独立预测因子及慢性心衰患者的危险分层指标[19]。本研究采用免疫组化技术发现缺血性心衰兔心肌组织中Gal-3表达增加，沙库巴曲缬沙坦可降低其表达水平，这与新近发表的有关沙库巴曲缬沙坦降低心衰患者血清Gal-3水平，改善心肌重构，降低死亡率，改善临床预后的研究相一致[20]。

综上所述，本研究发现沙库巴曲缬沙坦可改善缺血性心衰兔心室肌重构，其机制可能与下调心衰心肌组织中α-SMA、Gal-3蛋白表达，降低心肌纤维化有关。