不同产地山茱萸总皂苷及总环烯醚萜苷的地理变异分析

安淑静，牛豆，王婷，韩彬凯，王红菊，康杰芳

(陕西师范大学生命科学学院，教育部药用资源与天然药物化学重点实验室，西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西 西安 710119)

山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)是山茱萸科山茱萸属植物，又名山萸肉、枣皮、药枣等，始载于《神农本草经》[1]，其干燥成熟果肉可入药，具有补益肝肾、涩精固脱等功效[2]。研究表明山茱萸皂苷类和环烯醚萜苷类化合物是重要的生物活性成分，具有降血糖、抗氧化、抗炎、抗癌、神经保护、肝脏保护和肾脏保护[3-9]等作用。山茱萸主要分布在陕西、河南、浙江、山西、湖北和安徽等地。洑香香等[10]对4个地区7个山茱萸群体的种子形态指标变异、种子形态指标与环境因子的相关性、种子形态地理变异趋势和群体聚类进行了探讨，表明不同群体种子形态均存在显著差异；种子宽度与体积呈显著正相关，且二者与纬度呈显著负相关；种子宽度和种子体积的地理变异趋势明显。焦媛等[11]采用ICP-MS法分析5个产区22种无机元素的差异性，发现山茱萸中无机元素的含量与产地存在高度相关性。其他研究也发现山茱萸产地与其生物活性成分存在一定相关性[12-14]。

以上对于山茱萸有效成分的研究表明了不同产地间含量存在差异，但少有对有效成分含量与不同产地具体环境因素相关性研究的报道。寻找影响活性成分含量的具体环境因子对于优良产区的选择、品种选育、质量控制及规范化栽培有重要的指导作用。本研究对6个主产区15个产地的具体环境因素(纬度、经度、海拔、年降雨量、年均气温、年日照、无霜期)与山茱萸总皂苷和总环烯醚萜苷含量进行相关性和聚类分析，为山茱萸质量控制、优良产区筛选和规范化栽培等提供相关的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器

RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；MD-SpectraMax M5多功能酶标仪(Molecular Devices)；LG-04C微型植物粉碎机(瑞安市百信药机器械厂)；XH-B型旋涡混合器(美堰市康健有限公司)；XO-200超声微波反应系统(南京先欧仪器制造有限公司)；LC-2010A HT型高效液相色谱仪(日本 SHIMADZU)。

1.2 试药

15批山茱萸药材样品的地理信息见表1，经西北濒危药材资源开发国家工程实验室曹晓燕教授鉴定为山茱萸科山茱萸(CornusofficinalisSieb et.Zucc.)的成熟果肉。取山茱萸样品，粉碎，过40目筛，备用。

表1 不同产地山茱萸地理位置特征

齐墩果酸标准品(sigma公司)；马钱苷(批号：MUST-12052813)、獐牙菜苷(批号：MUST-13031124)、莫诺苷(批号：MUST-13070102)、山茱萸新苷(批号：MUST-12101526)均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98 %；乙腈(色谱纯)；冰乙酸(色谱纯)；其余试剂为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 总皂苷样液制备

称取样品1.00 g，70%乙醇提取，料液比为1∶21，超声功率471 W，微波功率369 W，5 min，抽滤，正丁醇萃取，旋转蒸发挥去正丁醇，定容至20 mL，备用，每个样本重复提取3次。

1.3.2 总环烯醚萜苷样液制备

称取样品1.00 g，80%甲醇提取，料液比为1∶21，超声功率357 W，微波功率641 W，9 min，抽滤，甲醇补到原始重量，0.22 μm微孔滤膜过滤，备用，每个样本重复提取3次。

1.3.3 总皂苷含量的测定

总皂苷含量的测定参照CHEN等[15]的方法，略作改动。取齐墩果酸标准品2.00 mg，定容至10 mL。取不同量标准品液制成0.003 6、0.004 8、0.006 0、0.007 2、0.008 4、0.009 6、0.010 8、0.012 0、0.013 2、0.014 4 mg/mL浓度的样品，水浴，冷却后加入0.20 mL香草醛-冰醋酸、0.80 mL高氯酸，60℃水浴15 min。冷却后加入5.00 mL冰醋酸，于550 nm下测吸光度。标准曲线为：A=0.037 6c-0.021 0，R2=0.999 2。吸取山茱萸样品50 μL，相同的方法测定，取3次结果平均值为测定结果。

1.3.4 总环烯醚萜苷含量测定

HPLC色谱条件： Phenomenex luna ODS 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温：35 ℃，波长：240 nm，流速：1.0 mL/min，进样量：10 μL。流动相：A (冰乙酸)，B(乙腈)；梯度洗脱：0～15 min，10%～20% B；15～19 min，20%～22% B；19～25 min，22%～25% B；25～35 min，25%～27% B；35～50 min，27%～70% B；50～55 min，70%～10% B。莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷和山茱萸新苷的线性回归方程见表2。在此条件下，测定各个成分的峰面积，计算各产地山茱萸药材环烯醚萜苷的含量，取3次平均值即为测定结果。

表2 各成分线性回归方程

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 不同产地山茱萸总皂苷和总环烯醚萜苷含量分析

表3显示了15批山茱萸药材中总皂苷和环烯醚萜苷的含量，不同产地之间含量存在显著差异，其中总皂苷含量以河南西峡最高，其次为陕西佛坪；总环烯醚萜苷含量以浙江淳安最高，其次为河南西峡；总皂苷含量的变化幅度为13.55～26.65 mg/g，总环烯醚萜苷含量的变化幅度为23.05～32.68 mg/g。

表3 不同产地山茱萸总皂苷和总环烯醚萜苷含量

对表3进行多重比较分析，结果显示15个产地间的山茱萸总皂苷和总环烯醚萜苷的含量存在显著差异。河南西峡、陕西佛坪的总皂苷含量最高，分别为26.22 mg/g、25.80 mg/g。安徽石台在所选的15个产地中含量最低，为13.55 mg/g，其中山西阳城、河南鲁山、浙江淳安、陕西丹凤、湖北保康、湖北南漳和湖北郧县7个产地之间总皂苷含量无明显差异，平均含量为17.86 mg/g。15个产地的总环烯醚萜苷含量多重比较分析表明，浙江淳安和河南西峡两地的总环烯醚萜苷含量最高，分别为32.67 mg/g和31.68 mg/g，但和陕西丹凤、佛坪等地差异不显著。

2.2 地理因子相关性分析

采用Person对总皂苷和环烯醚萜苷与产地地理因子进行相关性分析。表4显示山茱萸总皂苷含量与产地海拔、纬度和无霜期正相关，其中与海拔呈极显著正相关(P<0.01)，与经度、年降雨量、年日照、年均气温负相关，其中与经度呈显著负相关(P<0.05)，表明总皂苷含量随着海拔的升高而增加，随着经度的增加而减少，出现明显的东西部地域分化即西高东低的趋势；山茱萸总环烯醚萜苷与经度、年降雨量、年均气温、无霜期正相关，但相关性不显著(P>0.05)，与海拔、纬度负相关，但相关性也不显著(P>0.05)，与年日照无相关性，究其原因可能是由于不同产地对环境因子响应的差异性减弱了其相关性。图1显示总皂苷与经度、海拔之间的散点图，Loess加拟合线，结果显示山茱萸总皂苷含量随产地经度的增加逐渐递减，整体表现出西高东低的变化趋势，而随产地海拔的增加逐渐递增，与其他5个地理因子之间不显著相关；山茱萸总环烯醚萜苷含量与地理因子无显著相关，表明次生代谢产物是植物与环境长期相互作用的结果[16]，各种生态因子对植物的次生代谢产物起一种连续的、动态的生态综合作用，而不是单一的对植物起作用，影响着植物次生代谢产物的生成与动态变化[17-18]。

2.3 不同产地山茱萸总皂苷和总环烯醚萜苷含量的聚类分析

根据表4和图1的结果，对15个产地山茱萸的总皂苷和总环烯醚萜苷与海拔、经度进行SPSS聚类分析，结果如图2所示。15个产地的山茱萸种质资源大致可分为四类，第一类有4个产地，分别是：浙江临安、安徽歙县、安徽石台、安徽霍山，其皂苷平均含量为14.58 mg/g，总环烯醚萜苷平均含量为27.18 mg/g；第二类有5个产地，分别是：河南巩义、河南鲁山、浙江淳安、湖北南漳、湖北保康，其皂苷平均含量为17.28 mg/g，总环烯醚萜苷含量为30.32 mg/g；第三类有3个产地，分别是：湖北郧县、山西阳城、陕西丹凤，其皂苷平均含量为17.69 mg/g，总环烯醚萜苷含量为27.57 mg/g；第四类有3个产地，分别是：河南内乡、河南西峡、陕西佛坪，其皂苷平均含量为24.35 mg/g，总环烯醚萜苷含量为27.13 mg/g。在四类中，前两类经度较大，海拔较高，且亲缘关系和地理位置较近，又可聚为一大类，其皂苷及总环烯醚萜苷的平均含量为45 mg/g；后两类经度相对较小，海拔较高，且山茱萸中总皂苷及总环烯醚萜苷的平均含量为53.37 mg/g，其中的陕西丹凤、河南西峡、陕西佛坪的总皂苷及总环烯醚萜苷含量均较高，可作为山茱萸种质资源的优良产地。

表4 山茱萸总皂苷和总环烯醚萜苷含量与地理因子的相关系数分析

图1 山茱萸总皂苷含量与海拔和产地经度间的关系

图2 不同产地山茱萸总皂苷、总环烯醚萜苷的聚类分析图

3 讨论与结论

山茱萸为世界三大名贵木本药材之一，其药用和食用价值已具有1 500多年的历史，控制其质量对山茱萸的开发应用意义重大。2015年版《中国药典》以马钱苷和莫诺苷含量作为山茱萸质量的控制标准[2]。然而，仅以马钱苷和莫诺苷作为其质量的控制标准比较单一，缺乏全面性和系统性，寻找新的质量控制标准，有助于山茱萸类产品的深度开发，更好地应用于医药和保健行业。研究表明，山茱萸主要含有环烯醚萜苷、皂苷、有机酸、酯类、鞣质、黄酮和多糖等多种成分[19-21]。皂苷是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，陆地高等植物中含量较多，如人参、桔梗等，具有降血糖血脂、保护神经元、抗癌和保护肾脏等药理活性；万静枝等[22]发现竹节参皂苷通过激活Sirt1蛋白抑制线粒体功能障碍来改善D-半乳糖对神经细胞的损伤；张紫薇等[23]从耐药、抗炎和血管生成等多方面对薯蓣皂苷的抗癌机制进行阐述，为开发薯蓣皂苷的抗癌药物提供理论依据。王娟[24]等和关悦等[25]发现，人参皂苷Rg3和苦瓜总皂苷均对糖尿病肾病大鼠有保护作用。鉴于皂苷的药用价值，考虑亦可将总皂苷含量作为山茱萸质量控制的标准之一。环烯醚萜类化合物具有多种生物活性，其中马钱苷、莫诺苷和獐牙菜苷是山茱萸中最主要的环烯醚萜苷成分。许多研究表明[26]山茱萸环烯醚萜苷中含量较高的马钱苷与莫诺苷对保护神经元、抑制黑素和改善糖尿病有显著作用。HE等[27-28]发现山茱萸中的马钱苷，莫诺苷，熊果酸可以保护胰岛β细胞免受高糖诱导的过度氧化应激和细胞凋亡；LV、JIANG等[29-30]发现山茱萸环烯醚萜苷还可以通过减少NF-κB及其下游合成酶和细胞因子的产生显著减轻糖尿病器官损伤。因此，山茱萸中总皂苷和总环烯醚萜苷的含量，可为山茱萸质量控制提供重要参考依据。

山茱萸是多年生小乔木，喜生长在400～1 200 m海拔之间，主要分布于陕西、河南、浙江、安徽、山西和湖北，产地的不同，意味着海拔、温度、气候的差异性。本研究通过对不同产地山茱萸样品中总皂苷与总环烯醚萜苷的测量，结果显示不同产地间含量差异显著，表明地理因子对山茱萸总皂苷和总环烯醚萜苷含量有着重要的影响；有效成分产地地理环境因子的相关性发现，总皂苷含量与产地经度呈负相关、与海拔呈正相关，东西地域间存在明显的分化，即西部低于东部的变异趋势。郭兰萍[31]和NCUBE[32]研究表明，植物次生代谢产物受生态因素直接或间接的影响，如：产地气候、环境、土壤等，具有明显的地域特性；与海拔和地理位置有显著的相关性。因此，不同产地的地理因子的差异是造成山茱萸次生代谢物含量不同的主要因素。

近年来，道地性药材品质的提升是中药现代化的基石，需要根据产地地理环境、自然气候等自然环境特点对道地药材种植进行合理规划。因此，对于山茱萸资源发展和利用来说，探索山茱萸有效成分含量和环境因子的相关性将会为山茱萸道地性和有效成分形成的生态机制提供重要参考。在15个产地中，陕西丹凤、佛坪和河南西峡的皂苷和环烯醚萜苷的含量均较高，可作为山茱萸种质资源的优良产地。