温阳化浊方对阿霉素肾病大鼠保护作用及TRPC6表达的影响

李星瑶，赵延红，蔡子墨，叶冰玉，安鹏，张爱军，石兴民，董盛，吴喜利*

(1.西安交通大学第二附属医院，陕西 西安 710004；2.陕西省中西医结合医院，陕西 西安 710082；3.西安交通大学医学部，陕西 西安 710061；4.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712023)

1 材料

1.1 动物

60只SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，饲养温度保持在25 ℃，相对湿度为40%～60%，每天人工照明12 h。由西安交通大学医学部实验动物中心提供，许可证号：SCXK(陕)2012-003，所有操作均通过西安交通大学动物伦理委员会批准。

1.2 药物及试剂

复方由黑附片15 g(先煎)，生黄芪15 g，山萸肉15 g，金樱子45 g，芡实30 g，生大黄10 g(后下)，泽兰15 g，川芎15 g，桂枝25 g，茯苓15 g，车前子20 g(包煎)等组成。经煎煮、减压、过滤、浓缩得复方溶液，相当于生药浓度1.55 g/mL，实验时配制为高、中、低3种剂量溶液。注射用盐酸多柔比星(阿霉素)，海正辉瑞制药有限公司(H33021980)；醋酸泼尼松片，浙江仙琚制药股份有限公司(071 088)；蛋白抽提试剂盒，碧云天生物技术研究所(P0033)；兔抗TRPC6 IgG单克隆抗体，美国Abcam公司(ab137028)；小鼠抗β-Actin单克隆抗体，美国CMCTAG公司(AT0001)；HRP标记山羊抗兔IgG二抗，西安壮志生物科技有限公司(P48010)。SP法免疫组化染色法检测试剂盒，北京中杉金桥有限公司(SP-9000)。

1.3 仪器

TCS SP8激光共聚焦显微镜(德国Lecia公司)；Ti-E全自动荧光倒置显微镜(日本Nikon Eclipse)；G:Box凝胶成像系统(英国Syngene公司)；Revco Elite超低温冰箱(美国Thermo公司)；5810R冷冻型台式大容量高速离心机(德国Eppendorf公司)；蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)；半干转移槽(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分组及模型的制备

60只健康雄性SD大鼠随机分为6组(对照组、模型组、泼尼松组、温阳化浊方高剂量组、温阳化浊方中剂量组、温阳化浊方低剂量组)，每组10只，除对照组外，其余各组大鼠均按CHEN Z B[7]法经尾静脉分两次注射阿霉素进行造模，第一次经尾静脉注射阿霉素4 mg/kg，1周后第二次经尾静脉注射阿霉素3.5 mg/kg，对照组采用相同方法注射同体积的生理盐水。于第二次注射阿霉素1周后收集尿液，若检测出尿蛋白阳性，则模型制备成功。

2.2 给药

造模成功后，治疗组分别给予泼尼松组6.45 mg/(kg·d)，温阳化浊方高剂量组7.26 g/(kg·d)、中剂量组2.42 g/(kg·d)、低剂量组0.81 g/(kg·d)，用蒸馏水配成混悬液进行灌胃，灌胃按照动物和人的等效计量换算灌胃量，模型组和对照组给予2 mL蒸馏水灌胃，每日1次，连续灌胃56 d。

2.3 一般情况观察

观察实验大鼠精神状态、活动度、体质量、尿量、背毛色泽等。

2.4 尿液指标及甲状腺功能检测

分别于尾静脉注射阿霉素前1 天、第2次尾静脉注射阿霉素后第1周、灌胃干预后的第2、4、8周将各组大鼠放入代谢笼，收集24 h尿液，20 ℃，3 000 r/min，离心15 min，吸取上清液，采用邻苯三酚红比色法测定尿液24 h尿蛋白定量。实验结束时给予3%戊巴比妥麻醉，分离血清，放射免疫分析法检测样品中促甲状腺激素(TSH)、三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)。

2.5 肾脏病理指标

左肾分离被膜后分成2份，-80 ℃保存。取肾皮质切成小块后分别置于4%多聚甲醛固定，备用。肾组织进行HE染色，光学显微镜下观察并拍照。

2.6 激光共聚焦显微镜检测肾组织TRPC6蛋白表达

将肾组织冰冻切片后浸于丙酮固定，山羊血清封闭，加一抗孵育4 ℃过夜，次日加二抗室温孵育1 h，PBS清洗后DAPI染色，加荧光淬灭剂封片，在激光共聚焦显微镜下观察，TRPC6的阳性染色分布。

2.7 免疫组化法检测肾组织TRPC6蛋白表达

石蜡切片脱蜡水化，微波修复抗原，采用SP法免疫组化试剂盒，TRPC6(1∶300稀释)孵育，4 ℃过夜，二抗室温孵育30 min，DAB显色10 min，镜下观察后苏木素复染核10 min，所有步骤均参照说明书进行操作。在每张切片中随机选择20个连续不重复视野(×400)进行观察，拍照。

2.8 Western Blot法检测肾组织TRPC6的表达

称取200 mg肾组织，加RIPA组织裂解液，匀浆3次，冰上裂解30 min后4 ℃，12 000 r/min，离心15 min，取上清液。10 000 r/min离心5 min得蛋白提取液，BCA法测定蛋白浓度。取40 μg蛋白，以SDS-PAGE电泳法分离蛋白，转膜、封闭、孵育一抗TRPC6(1∶10 000)、HRP标记的二抗(1∶5 000)孵育2 h后洗膜，显色、拍照，统计分析。

2.9 统计学分析

3 结果

3.1 一般情况

注射阿霉素后第1周除对照组外，其余各组大鼠精神稍差，食欲可，活动及大小便均尚可。在第2次注射阿霉素后约3 d大鼠逐渐出现精神和食欲明显变差，并有脱毛及腹泻表现，约第5天时部分大鼠出现口鼻有血性分泌物及烂尾现象。温阳化浊方高、中、低剂量组及泼尼松组于灌胃后第4周开始，大鼠体质量明显增加，精神及食欲状况不同程度好转，但开始出现较为明显的水肿；模型组大鼠一般情况无明显改善且水肿程度相对其余各组较重。

3.2 对ADR肾病大鼠24 h尿蛋白定量的影响

与对照组比较，其余各组经造模处理后第2、4、8周24 h尿蛋白量均有不同程度升高；造模后2周，与模型组比较，各治疗组的大鼠24 h尿蛋白定量变化显著(P<0.05)；造模后4周时，与模型组比较，各治疗组大鼠24 h尿蛋白定量明显降低(P<0.05)；经药物治疗8周后，与模型组比较，各治疗组大鼠24 h尿蛋白定量明显降低(P<0.05)，提示各治疗组均有降低尿蛋白作用，且温阳化浊方高剂量组与泼尼松组相比较有统计学意义(P<0.05)，提示高剂量温阳化浊方降蛋白效果更好，见表1。

表1 各组对ADR肾病大鼠24 h尿蛋白定量的影响

3.3 对ADR肾病大鼠血清甲状腺激素水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清中TSH、T3水平显著升高，T4水平降低(P<0.05)；与模型组比较，各治疗组大鼠血清T4水平明显升高，而T3及TSH水平明显降低(P<0.05)；温阳化浊方高、中、低剂量组对血清T4水平的影响有统计学意义(P<0.05)；温阳化浊方高剂量对TSH水平的影响有统计学意义(P<0.05)。综合3项血清水平，提示温阳化浊方改善甲状腺功能的效果优于激素，见表2。

表2 各组对大鼠血清甲状腺激素水平的影响

3.4 对ADR肾病大鼠肾组织病理学的影响

HE染色结果显示，对照组大鼠肾小球结构正常，基底膜完整，系膜及基质未见增生，肾小管间质正常，皮髓质分界清晰(图1A，图2A)。模型组可见系膜细胞及基质轻度增生，毛细血管内皮细胞空泡变性，管腔变窄并有瘀血，肾小管上皮细胞肿胀、脱落，管腔内存在大量蛋白管型，肾间质可见炎性细胞浸润，少部分肾小球出现球囊壁纤维化及毛细血管襻节段性硬化(图1B，图2B)；各治疗组球囊腔变窄减轻，蛋白管型明显减少，且温阳化浊方高、中剂量组肾脏整体病理损伤轻于泼尼松组及温阳化浊方低剂量组(图1WM、图1WH、图2WM、图2WH)。

3.5 对ADR肾病大鼠肾脏组织TRPC6蛋白水平的影响

免疫组化法染色结果显示，对照组TRPC6蛋白在肾小球和肾小管均有表达，在肾小球中分布不均，染色强度较弱，面积较少，呈团块状或仅有颗粒状分布；在肾小管近曲及远曲小管上皮细胞中有棕黄色的阳性染色颗粒(图3A、图4A)。与对照组比较，模型组肾小球及肾小管中TRPC6染色强度增加(图3B、图4B)；与模型组比较，各治疗组肾小球及肾小管中TRPC6表达呈不同程度减少(图3WL、图3WM、图3WH、图4WL、图4WM、图4WH)。

激光共聚焦荧光显微镜检测TRPC6蛋白，对照组大鼠肾脏TRPC6表达微弱(图5A)，在模型组中，TRPC6表达最强，分布最广(图5B)；温阳化浊方低、中、高剂量组以及泼尼松组干预后TRPC6荧光强度明显减弱，分布区域也相对减少，但其组间无明显差异性(图5C、图5WL、图5WM、图5WH)。

注：A.对照组；B.模型组；C.泼尼松组；WL.温阳化浊方低剂量组；WM.温阳化浊方中剂量组；WH.温阳化浊方高剂量组。图1 各组对ADR肾病大鼠肾小球病理学的影响(HE染色)

注：A.对照组；B.模型组；C.泼尼松组；WL.温阳化浊方低剂量组；WM.温阳化浊方中剂量组；WH.温阳化浊方高剂量组。图2 各组对ADR肾病大鼠肾小管病理学的影响(HE染色)

注：A.对照组；B.模型组；C.泼尼松组；WL.温阳化浊方低剂量组；WM.温阳化浊方中剂量组；WH.温阳化浊方高剂量组。图3 各组对大鼠肾小球中TRPC6蛋白表达的影响(Masson染色)

注：A.对照组；B.模型组；C.泼尼松组；WL.温阳化浊方低剂量组；WM.温阳化浊方中剂量组；WH.温阳化浊方高剂量组。图4 各组对大鼠肾小管中TRPC6蛋白水平的影响(Masson染色)

注：A.对照组；B.模型组；C.泼尼松组；WL.温阳化浊方低剂量组；WM.温阳化浊方中剂量组；WH.温阳化浊方高剂量组。图5 激光共聚焦检测各组对大鼠TRPC6 的表达情况

Western Blot法检测各组大鼠肾组织中TRPC6蛋白的表达。与模型组比较，各治疗组均能不同程度的下调大鼠肾组织TRPC6蛋白的表达(P<0.01)(表3，图6)。

表3 温阳化浊方对大鼠肾组织TRPC6蛋白水平的影响

注：A.对照组；B.模型组；C.泼尼松组；WL.温阳化浊方低剂量组；WM.温阳化浊方中剂量组；WH.温阳化浊方高剂量组。与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.01，##P<0.01。图6 Western Blot检测TRPC6蛋白表达情况

4 讨论

温阳化浊方是在陕西省名老中医乔成林教授“治水必先温通”的学术理论指导下创立的治疗肾性蛋白尿的临床有效方剂[8]。该方由黑附片、生黄芪、山萸肉、金樱子、芡实、生大黄、泽兰、川芎、桂枝、茯苓、车前子等药物组成。现代药理研究认为，附子具有抗炎、增强免疫、扩张外周血管、保护肾功能的作用[9-10]；大黄能够抑制肾单位高代谢，延缓肾小球硬化，抑制系膜细胞增生[11]，还可改善肾衰患者的高凝状态，减少蛋白尿[12]；黄芪可改善全身血流，以及调节蛋白质和脂质代谢[13-14]；山茱萸双向调节免疫，促进巨噬细胞发挥吞噬功能[15]；泽兰具有抗凝血、调节血脂代谢、升高血清总蛋白和白蛋白的作用[16]；川芎可改善患者高凝状态，具有一定抗炎作用[17]。

TRPC6属于一种压力激活的机械敏感性钙离子通道，其可产生由机械和渗透作用而诱导的膜牵张反应，在压力的诱导下TRPC6的活化不依赖于磷脂酶C，TRPC突变可以改变静水压驱动的超滤作用，从而引起蛋白尿和肾小球硬化[18-19]，并且其开放可触发感受器细胞胞内Ca2+浓度升高以及胞膜的去极化，继而促进动作电位发出，激活胞内信号转导机制，对细胞生理功能进行调控[20]。本研究显示温阳化浊方可明显减少尿蛋白、改善甲状腺功能及减轻肾脏病理损害。同时中药各治疗组均能不同程度下调肾脏组织TRPC6蛋白的表达，提示这可能是温阳化浊方防治肾病的作用机制之一。但由于TRPC6信号通路相当复杂，还需进行更深层次的探讨，而对于临床治疗NS，使用抑制TRPC6表达或降低其活性的药物可能是未来一个理想的治疗方案。