响应面优化黄精根茎总皂苷、总黄酮提取方法及其在不同产地黄精成分含量比较中的应用

黄金月，崔芙岩，郑时嘉，姜佳欣，杨佳颖，王志刚，于纯淼，杨波*

(1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.天问山农业综合开发股份有限公司，黑龙江 哈尔滨 150300)

中国药典中记载的黄精药材(Polygonatirhizoma)为百合科植物黄精(PolygonatumsibiricumRed.)、滇黄精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.)或多花黄精(PolygonatumcyrtonemaHua)的干燥根茎，根据形状有“鸡头黄精”“姜形黄精”“卷叶黄精”别称[1]，富含皂苷、黄酮、多糖等活性成分，具有保肝护肾、降脂降糖、增强免疫力等药理作用[2]。黄精多产于东北、河北等北方地区；滇黄精多产于云南、四川、贵州等地；多花黄精多产于湖南、湖北、江苏、安徽等地[3]。皂苷、黄酮是黄精中较为重要的活性成分，也是衡量各产地黄精的重要指标，但目前尚无对中国药典3种黄精根茎中总皂苷、总黄酮含量进行比较的报道。

在黄精有效成分的各种提取方法中，加热回流法的时间长、操作繁琐[4]；闪式提取法的提取容器受限、破碎后过滤难[5]；微波消解法的成分易分解、条件不好掌握[6]，而超声辅助提取法的提取率高、时间短、适用范围广[7]。在各种提取条件优化方法中，正交试验只能对一个孤立点分析，而响应面法可以对各水平连续分析[8]。本研究以响应面法优化超声辅助乙醇提取黄精根茎中总皂苷、总黄酮，对3种黄精中总皂苷、总黄酮的含量进行比较，为各产地黄精的质量控制和资源开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器

GR150B研磨机：合肥荣事达小家电有限公司；KQ-250B型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；岛津UVmini-1240紫外分光光度计：岛津企业管理(中国)有限公司。

1.2 试剂与药品

分析纯香草醛、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、冰乙酸、高氯酸、无水乙醇、95 %乙醇、甲醇购自天津市富宇精细化工有限公司；对照品：人参皂苷Rb1(批号：110704-202028，含量≥98 %)、芦丁(批号：100080-201811，含量≥98 %)均购自中国食品药品检定研究院。

1.3 药材

黄精生药材经黑龙江中医药大学药学院孙慧峰教授鉴定为黄精、滇黄精及多花黄精，详见表1。

表1 黄精生药材来源、产地、品种及批号

2 方法

2.1 黄精总皂苷、总黄酮的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称定人参皂苷Rb1、芦丁对照品各2 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，分别用甲醇、60%乙醇定容至刻度线，混匀，配制成0.2 mg/mL的人参皂苷Rb1、芦丁对照品溶液，置4 ℃冰箱冷藏备用[9-10]。

2.1.2 供试品溶液的制备

黄精根茎，切片，置60 ℃烘箱干燥至恒重，粉碎，过4号筛。称取黄精粉末3 g，置150 mL锥形瓶中，加80%乙醇20 mL，超声0.5 h，提取3次，合并滤液，离心，取上清液水浴挥去乙醇至无醇味。用等体积正丁醇萃取3次，减压挥去正丁醇，用甲醇复溶于10 mL容量瓶中，即总皂苷供试液；用等体积乙酸乙酯萃取3次，减压挥去乙酸乙酯，用60%乙醇复溶于10 mL容量瓶中，即总黄酮供试液[9-10]。

2.1.3 对照品及供试品溶液显色

2.1.3.1 人参皂苷Rb1对照品及总皂苷供试品溶液显色

60 ℃水浴蒸干溶剂，加入新鲜配制的5%香草醛冰醋酸0.2 mL，冰浴下加入高氯酸0.8 mL，混匀，在60 ℃水浴下显色18 min，转移至10 mL具塞试管中，冰浴冷却2 min，加入冰醋酸5 mL，混匀，静置3 min。以甲醇为空白对照[10-11]。

2.1.3.2 芦丁对照品及总黄酮供试品溶液显色

将对照品及供试品溶液各浓缩至1 mL，转移至25 mL容量瓶中，加入5 %亚硝酸钠1 mL，混匀，静置5 min，加入10%硝酸铝1 mL，混匀，静置5 min，加入4%氢氧化钠10 mL，用60%乙醇定容至刻度线处，混匀，静置13 min。以60%乙醇为空白对照[10-11]。

2.1.4 检测波长的确定

将显色的对照品及供试品溶液，用紫外分光光度计在200～700 nm范围内扫描，测得总皂苷最大吸收波长为540 nm、总黄酮最大吸收波长为505 nm，分别定为总皂苷、总黄酮的检测波长[10]。

2.1.5 标准曲线的绘制

精密吸取人参皂苷Rb1对照品溶液各0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL置10 mL具塞试管中；芦丁对照品溶液各0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL置25 mL容量瓶中，按上述方法显色分别于540 nm、505 nm波长处测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，人参皂苷Rb1、芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线[10]，得总皂苷回归方程：Y=6.433 9X+0.135 6(r=0.999 2)，线性范围：0.016～0.103 mg/mL；总黄酮回归方程：Y=9.652 7X-0.000 9(r=0.999 8)，线性范围：0～0.083 mg/mL。

2.1.6 样品含量测定

准确称量黄精粉末3 g，按上述方法制备显色后分别于540 nm、505 nm测定吸光度值，平行测定3 次，代入各自回归方程，计算含量后取平均值[10]。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验

取上述对照品溶液，连续测定6次，测得RSD均<1.610%。

2.2.2 回收率试验

取已知总皂苷、总黄酮含量的供试液各1 mL，共6份，分别加入对照品溶液1 800 μL、300 μL，按上述方法测定，测得RSD均<2.798%。

2.2.3 稳定性试验

按上述方法制备供试液，在0、5、10、15、20、25、30 min时测定，测得RSD均<0.310%。

2.2.4 重复性试验

按上述方法制备供试液，连续测定5次，测得RSD均<0.200%。

2.3 响应面优化试验

以液料比(A)、提取时间(B)、提取次数(C)为单因素试验的3个考察因素，确定提取的适宜范围为液料比15～25、提取时间1～2 h、提取次数1～3 次，作为响应面优化的基础。结合Box-Behnken中心组合实验设计及Design Expert10.0.7软件，采用以液料比(A)、提取时间(B)、提取次数(C)为自变量，总皂苷、总黄酮提取率(Y)为因变量的3因素3水平，进行响应面分析，因素与水平设计见表2[12]。

表2 响应面分析因素与水平

3 结果与分析

3.1 响应面优化结果

响应面优化设计及结果见表3。

表3 响应面优化设计与结果

3.2 响应面方差及曲面分析

利用Design Exerpt10.0.7软件对实验数据进行回归拟合，得总皂苷二次回归方程：Y=0.720+0.042A+0.029B+0.150C+0.015AB+0.025AC+0.002 5BC-0.032A2-0.015B2+0.020C2;总黄酮二次回归方程：Y=0.15+0.005 463A+0.015B+0.053C+0.001AB+0.007 075AC-0.007 35BC-0.015A2-0.006 288B2-0.018C2。显著性试验P<0.01，表明该模型具有统计学意义，可用于响应值的预测，响应面曲面分析见图1～图6。

由图1～图6可知，对黄精总皂苷、总黄酮提取率的影响大小顺序为：液料比>提取次数>提取时间。采用Design Exerpt10.0.7软件得出的最优提取条件为液料比25∶1、提取时间2 h、提取次数3次，预测总皂苷含量9.611 mg/g、总黄酮含量1.883 mg/g。

图1 液料比与提取时间对总皂苷提取率的交互影响

图2 液料比与提取次数对总皂苷提取率的交互影响

图3 提取时间与提取次数对总皂苷提取率的交互影响

图4 液料比与提取时间对总黄酮提取率的交互影响

图5 液料比与提取次数对总黄酮提取率的交互影响

图6 提取时间与提取次数对总黄酮提取率的交互影响

3.3 各产地黄精成分含量比较

3种黄精的每个批次均进行3次平行测定，结果见表4。

表4 3种黄精中总皂苷、总黄酮含量

由表4可见，3种黄精中总皂苷、总黄酮含量各有差异，其中黄精中总皂苷含量显著多于滇黄精及多花黄精，而总黄酮含量差异较小，黄精中总黄酮含量略多于滇黄精及多花黄精。

4 讨论

中国药典中记载的黄精为传统药食同源植物，具有极高的药用价值。此前黄精有效成分研究多集中于多糖的提取工艺及含量测定，而总皂苷、总黄酮也是其重要的活性成分。李丽等[6]优化了黄精中总黄酮的提取条件，而对总皂苷未做分析；苑璐等[9]对崂山种植的黄精中总皂苷提取条件进行了优化，而未与其他产地黄精进比较分析；张丽等[10]优化了黄精茎秆中总多糖、总皂苷及总黄酮的提取条件，但茎秆并非中国药典所记载的黄精主要药用部位。本研究以响应面法精确地优化了黄精最重要的药用部位—根茎中总皂苷、总黄酮的超声辅助乙醇提取条件，并对中国药典中3种黄精的总皂苷、总黄酮含量进行了比较分析。黄精(东北)中总皂苷、总黄酮含量多于滇黄精及多花黄精，体现了黄精(东北)药用价值的优越性，本研究方法及结果为各产地黄精的质量控制和资源开发提供参考。