巨噬细胞极化与脂多糖致新生大鼠支气管肺发育不良的相关分析研究

甄宏，胡洪玻，荣国杰，黄秀秀，谭嫦，余新圆

（广西医大开元埌东医院 儿科，广西 南宁 530021）

支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）是早产儿中常见的一种慢性肺部疾病，同时也是引起早产儿死亡并导致其后遗症的最主要因素［1-3］。BPD 是一种复杂的发病机制，涉及多种病变不成熟的肺，导致肺泡不同程度的简单化和细支气管的结构和功能改变［4］。细菌脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）可引起肺炎症，导致新生大鼠的高死亡率并且随后阻滞肺泡的形成，这是BPD 的经典动物模型之一［5-6］。巨噬细胞是单核巨噬细胞系统分化的最终细胞，存在于组织中的巨噬细胞是防御外来入侵的第一道屏障，并在先天免疫中协调白细胞的渗透；其在特异性免疫中作为抗原提呈细胞和重要的炎症细胞发挥着始动作用［7］。巨噬细胞激活后可发生表型变化，其称为巨噬细胞极化。

一般来说，经典激活途径极化的M1 型巨噬细胞具有促炎作用，而替代激活途径极化的M2 型巨噬细胞具有促进组织修复和再生作用。M1/M2 表型的巨噬细胞常在促炎/抑炎作用间保持平衡［8-9］。本研究通过LPS 作用于新生SD 大鼠建立BPD 动物模型，观察不同时间点的肺部组织病理变化及巨噬细胞M1/M2 表型的变化，探讨BPD 发病与巨噬细胞激活和极化的相关性，为BPD 的辅助治疗开辟新途径。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验开始前购入SD 大鼠23 只。其中，雌性15 只和雄性8 只，12 周龄，每只大鼠体重180～220 g，平均（190.37±5.29）g，均购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司［许可证号：SCXK（湘）2016-0002］。所有大鼠标准饲养（湿度60%，温度23～25℃），饲喂自由饮水、日常光照，所有操作遵守动物伦理法。将性成熟的SD 大鼠按照雌雄比2∶1 进行合笼，观察并记录雌鼠生产日期，出生幼鼠用于实验。使用腹腔注射LPS 的方法构造新生大鼠支气管肺发育不良模型，并在其出生后第1、3、5 天分别注射LPS 剂量为1 mg/kg、1 mg/kg 和2 mg/kg。选取成功造模的27 只作为LPS 组，并选取27 只新生大鼠腹腔在其出生后第1、3、5 天注射等量生理盐水作为对照组。本研究所纳入的54 只4 日龄SD 大鼠，每只体重约为6～10 g，平均（8.37±1.29）g。

1.2 实验试剂与仪器

细菌脂多糖LPS（美国Sigma 公司），小鼠抗大鼠CD68 抗体、兔抗CD163、FITC 标记山羊抗小鼠IgG（英国Abcam 公司），兔抗大鼠Arg-1 抗体、兔抗大鼠iNOS 抗体（美国Affinity 公司），Cy3 标记山羊抗兔IgG、RNA 提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），流式细胞术抗体CD68-FITC、PE 标记抗兔IgG 抗体（美国Thermofisher 公司），抗CD45 PerCP/Cy5.5、抗CD86-PE（美国Biolegend 公司），荧光显微镜（日本OLYMPUS 株式会社），NovoCyte™流式细胞仪（杭州艾森生物有限公司），CFX Connect™实时荧光PCR 仪（上海伯乐生命医学产品有限公司）。

1.3 支气管肺发育不良模型构建及实验分组

使用腹腔注射LPS 的方法构造新生大鼠支气管肺发育不良模型，在其出生后第1、3、5 天分别注射LPS 剂量为1 mg/kg、1 mg/kg 和2 mg/kg。利用病理切片苏木精-伊红（HE）染色验证其模型是否成功，染色后显微镜下观察到放射状肺泡计数较小、呼吸膜厚度增厚、肺纤维化加重则为造模成功［10］。选取成功造模的27 只作为LPS 组，并选取27 只新生大鼠腹腔在其出生后第1、3、5日龄注射等量生理盐水作为对照组。两组大鼠分别于10 日龄、14 日龄、21 日龄时各取9 只幼鼠进行观察：3 只做病理学形态检查；3 只做流式细胞仪检查；3 只做PCR 检查。

1.4 肺部组织病理切片HE 染色

取出鼠肺组织常规石蜡包埋、切片、脱蜡、水化后进行HE 染色，显微镜下观察。

1.5 免疫组织化学染色

组织切片经抗原修复后与小鼠抗大鼠CD68 抗体（1∶200）4℃孵育过夜，在室温静置45 min。PBS 浸洗玻片后滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（1∶200）37℃孵育30 min，PBS 充分淋洗。DAB 显色5～10 min，苏木精复染、返蓝、脱水、透明、封片、镜检。

1.6 免疫荧光

组织切片水化、抗原修复、通透后予5%BSA封闭30 min。M1 型巨噬细胞染色为小鼠抗大鼠CD68抗体（1∶300）和兔抗大鼠Arg-1抗体（1∶200）。M2 型巨噬细胞染色为小鼠抗大鼠CD68抗体（1∶300）和兔抗大鼠iNOS 抗体（1∶200），4℃孵育过夜。玻片复温至室温后，PBS 浸片后滴加FITC 标记山羊抗小鼠IgG（1∶200），Cy3 标记羊抗兔IgG（1∶200），湿盒中37℃孵育30 min。滴加DAPI 避光孵育5 min，对标本进行染核，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片、镜检。

1.7 流式检测

收集大鼠肺泡灌洗液，用100 μm 滤网过滤去除组织块，收集滤液1 500 r/min 离心弃上清，PBS洗涤两遍。加入100 μL PBS 重悬细胞，并平分为A、B 两管。A 管加入CD68-FITC、CD45 PerCP/Cy5.5、CD86-PE 抗 体；B 管 加 入CD68-FITC、CD45 PerCP/Cy5.5、CD163 抗体，常规孵育染色后。A 管加入500 μL PBS 液重悬细胞混匀后上流式仪检测；B 管加入PE 荧光标记的抗CD163 二抗，孵育染色、重悬细胞混匀后上流式仪检测。A管先以CD45 阳性设门、再以CD68 阳性设门，分析CD45/CD68/CD86 三阳性细胞在CD45/CD68 双阳性细胞中的比例，即为M1 型巨噬细胞占巨噬细胞的比例（M1%）；B 管同样以CD45 阳性和CD68阳性设门后，分析CD45/CD68/CD163 三阳性细胞在CD45/CD68 双阳性细胞中的比例，即为M2 型巨噬细胞占巨噬细胞的比例（M2%）。M1% 和M2%的数值相加为极化巨噬细胞占总巨噬细胞的比例（M 极化%）。

1.8 荧光定量PCR 检测

各组进行RNA 的提取，提取RNA 后根据逆转录试剂盒合成cDNA。以cDNA 为模板，在荧光定量PCR 仪上进行检测。以β-actin 为内参，以对照组的相应基因表达为基数1，2-△△Ct法计算出各组肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α），白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10），一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）和精氨酸酶-1（arginase-1,Arg-1）基因mRNA 相对表达量。实验条件：95℃预变性10min，95℃变性10 s，54.3℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 个循环（见表1）。融解曲线分析：95℃15 s，54.3℃1 min，95℃15 s，54.3℃15 s，54.3℃15 s。

表1 各指标引物序列情况

1.9 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件，作图采用Graphpadprism 8.0 软件。计量资料以均数±标准差（）表示，比较用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理HE 染色结果

随着日龄的增长，对照组大鼠肺泡逐渐分化成熟，各时间点的肺泡大小均匀、形态规则，肺泡间隔无增厚，肺泡腔内未见炎性细胞浸润。随着日龄的增长，LPS 组大鼠肺泡结构紊乱，肺泡间隔明显增厚，并伴肺泡腔及肺间隔周围有炎性细胞浸润，21 d 时可见明显的肺泡简单化。见图1。

图1 病理HE 染色（×200）

2.2 免疫组织化学染色CD68 表达结果

染色后CD68 阳性表达呈现胞浆褐色，10 日龄、14 日龄、21 日龄时LPS 组大鼠的CD68 阳性表达细胞数量多于对照组。见图2。

图2 免疫组织化学染色肺组织中CD68 表达结果

2.3 免疫荧光染色M1 和M2 型巨噬细胞结果

CD68（FITC 标记呈现绿色荧光）与iNOS（Cy3 标记呈现红色荧光）M1 型巨噬细胞，CD68与Arg-1（Cy3 标记呈现红色荧光）标记M2 型巨噬细胞，阳性结果呈现橙色。10 日龄、14 日龄、21 日龄时LPS 组大鼠的M1 型和M2 型巨噬细胞多于对照组，且21 d 时LPS 组M2 型巨噬细胞增加比M1 型更明显。见图3。

图3 免疫荧光染色肺组织中M1 和M2 型巨噬细胞表达结果（×200）

2.4 流式检测各组各时间点肺泡灌洗液中M1 和M2 型巨噬细胞表达结果

对照组第10、14 和21 天中巨噬细胞极化的比率呈现逐渐增加的趋势。而LPS 组第10 天已处于较高的极化率值。两组比较，差异有统计学意义（t=-2.150,P=0.047）。LPS 组第14 天与对照组数值接近（t=-0.803,P=0.434），但在第21 天较对照组稍低，但差异无统计学意义（t=1.811,P=0.089）。M1%∶M2%比值分析结果显示，对照组第10 天以M1 极化为主，之后演变为M2 极化为主。而LPS 组一直以M2 极化为主，第10 天和第21 天M1%∶M2% 比值均较对照组低，差异有统计学意义（t=4.654 和4.465，均P<0.001）。见图4。

图4 流式细胞术检测肺泡灌洗液中M1 和M2 型巨噬细胞结果

2.5 荧光实时定量PCR 检测TNF-α、IL-10、iNOS 和Arg-1 表达结果

以对照组基因表达为1，2-△△Ct法计算LPS 组各基因的相对表达量。LPS 组Arg-1 基因相对表达量与对照组有1 倍以上差异：LPS 组第10 天Arg-1 mRNA 表达减少至对照组（0.43±0.21）倍，而在第21 天表达明显增加至（2.33±0.75）倍。两组TNF-α、IL-10、iNOS 的mRNA 表达差 异<1 倍。见图5。

图5 LPS 组TNF-α、IL-10、NOS 和Arg-1 基因mRNA 相对表达量

3 讨论

常用的BPD 造模方法有高氧暴露、机械通气损伤诱导、宫内炎症诱导、低氧诱导或复合因素诱导等，由于炎症被认为是BPD 发生、发展过程中的基石［11］，因此模拟炎症诱导模型鼠肺泡发育受阻，更符合BPD 的病理生理变化及临床本质，其是研究BPD 的理想动物模型。肺发育可分为胚胎期、假腺期、微管期、囊状期和肺泡期等五个阶段。容易出现BPD 的早产儿出生时常处于微管期晚期或囊状期的早期，而在啮齿动物中，囊状期则发生在宫内直到出生后5 d。因此采用新生鼠进行BPD 造模，能够较好地模拟人类早产儿的病理生理状态［6］。

巨噬细胞M1 极化、M2 极化能够促使巨噬细胞在炎症部位聚集、增生和活化，进而分泌大量的炎症因子，活化的炎症因子又会对巨噬细胞的释放起到促进作用，因此炎症部位聚集大量的炎症因子，炎症反应增强［12］。当肺部出现炎症反应时，大量的炎症因子和炎症细胞在肺毛细血管和肺泡腔内聚集，炎症反应增强，对正常肺组织造成损坏，增加毛细血管的通透性和肺泡的受损程度，最终导致肺部炎症反应失调、阻碍肺发育，造成支气管肺发育不良［13］。有体外细胞实验发现，LPS 可引起巨噬细胞M1 极化，其特征是诱导iNOS 和TNF-ɑ 的产生［14］；或在低LPS 浓度时引起M2 表型极化、高LPS 浓度时引起M1 表型极化［15］。本研究基于动物模型发现LPS 引起肺内巨噬细胞以M2 极化为优势，这一发现与ZARAMELLA 等［16］在人体中的观察结果有吻合之处。该研究在发展为BPD 的早产儿肺泡灌洗液中发现了巨噬细胞以M2 极化为优势。目前被较广泛接受的观点认为巨噬细胞M1/M2 极化的平衡影响着器官炎症/外伤后的结局。其在感染或炎症之初，巨噬细胞常以M1 极化为主，释放TNF-α、IL-1b等因子；但如果M1 时相持续，则可能导致组织损伤。因此在M1 应激后继之以M2 极化为优势，分泌IL-10 和TGF-b 等来抑制炎症，有助于促进组织修复、回归稳态［8-9］。因此本研究结果显示天时，LPS 组出生后第21 天肺内Arg-1 基因表达明显上调，分析原因可能与巨噬细胞的M2 极化优势有关。

由于精氨酸酶（Arg）与一氧化氮合酶（NOS）共用底物L-精氨酸，两种酶具有竞争关系，而两者的作用正好相反。NOS 作用产生NO（一氧化氮），促进巨噬细胞向M1 型分化、促进血管舒张。因此除了影响M1/M2 巨噬细胞极化的平衡所致的炎症和修复外，Arg-1 和NOS 还是一对影响肺血管收缩/舒张和增殖的因子，其比值（平衡）可能对发育中的肺血管网形成产生影响。有研究发现，Arg-1 基因的单核苷酸多态性影响NOS 介导的细胞凋亡，从而可以影响支气管肺发育不良继发的肺动脉高压［17］。本研究发现，LPS 刺激后，新生鼠出生后第21 天Arg-1 mRNA 表达明显上调，而NOS 表达相对无明显变化。这样的Arg-1/NOS 表达失衡可能对肺血管的发生产生影响，进而加速BPD 的病理进展。BPD 特征性的病理生理学改变中，表现除了肺泡简单化和数量减少外，肺泡血管形成不良［4］，甚至可继发肺动脉高压［18］，其已日益为人们所重视。本研究结果还发现，LPS 引起新生大鼠肺中Arg-1 的异常增高表达，可能成为探索BPD 发病机制的重要线索。

综上所述，LPS 引起新生大鼠的肺损伤在14～21 日龄后发展为支气管肺发育不良表型，伴随着巨噬细胞的浸润增加和M1/M2 型极化，巨噬细胞激活及M1/M2 型极化可通过肺炎症反应失调而阻碍肺发育。巨噬细胞高表达提示可能存在支气管肺发育不良，其可用于提前诊断。