滇丹参质量标准研究

★ 康兴东 周朝忠 张金良 毛金娣 胡吉忠（.江西普正制药股份有限公司 江西吉安 34300；2.江西省中药消炎药工程技术研究中心 江西 吉安 34300）

滇丹参为唇形科植物云南鼠尾草Salvia yunnanensisC.H.Wright的干燥根，又名丹参、小丹参、紫丹参等，具有活血祛瘀，凉血止血，养心安神，解毒消肿的功效。其可用于月经不调，痛经，经闭，恶露腹痛，症瘕，胸痹绞痛，关节痛，疝痛，崩漏，吐血，衄血，咳血，血虚肢麻，失眠，健忘，惊悸，怔忡，乳痈，疮肿，跌打瘀肿等疾病的治疗，主产于云南、四川、贵州等地［1］。滇丹参的化学成分以萜类化合物和酚酸类化合物为主，还包括甾体、黄酮类等成分［2-5］。

滇丹参作为地方习用药材，目前尚无国家药材标准，仅《云南省中药材标准》等地方中药材标准有收载，但较为粗疏。本实验采集10批不同产地滇丹参，考察其性状、显微特征、TLC薄层色谱特征、水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物等方面，并测定丹参酮ⅡA和丹酚酸B含量，为该药材质量标准建立和规范使用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器设备 美国Waters1525-2489型高效液相色谱仪；AUW2200十万分之一电子分析天平（SHIMADZU 岛津）；AB104-N万分之一天平（梅特勒-托利多）；JK-300型超声波清洗仪（合肥金尼克机械制造有限公司）；SK160 Digital生物显微镜（麦克迪奥光学仪器有限公司）；SX2-4-10 马弗炉（上海实验仪器厂）。

1.2 试剂与试药 丹酚酸B对照品（111562-201110）、丹参酮ⅡA（110766-200619）、丹参对照药材（120923-201414）购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，西陇科学股份有限公司）、甲醇（分析纯，天津市恒兴化学试剂有限公司）、甲酸（分析纯，天津市恒兴化学试剂有限公司）、水均来自自制超纯水。硅胶G薄层板、硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工厂）。

滇丹参药材共10批，产自云南省各地，具体信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 性状鉴别 滇丹参为圆锥形，具分枝，长5～15 cm，直径0.4～1.0 cm；芦头具密集的叶痕而成节，常扭曲。根表面有细根痕及纵皱纹，支根略呈纺锤形。表面紫褐色，质坚脆，易折断；断面不平整，外层有时暗棕色，内圈呈紫红色、浅棕黄色。气微，味苦涩、微甘。见图1。

图1 滇丹参药材性状

2.2 显微鉴别

2.2.1 根横切面特征木栓层为2～4列木栓细胞，皮层较宽，外侧石细胞单个散在或2～5个成群，石细胞方形、长方形或长椭圆形，直径17～48 µm，长至130 µm，壁厚1.5～3 µm，向内侧渐变小；内侧纤维极多，单个散在或2～20余个成群，纤维方形或多角形，直径8～20 µm，壁厚3～15 µm，可见孔沟及层纹。韧皮部较窄，外侧有少数纤维。形成层成环。木质部导管束4～10束，向外渐宽。中央多为薄壁细胞。见图2。

图2 滇丹参根横切面显微图

2.2.2 粉末特征石细胞多见，单个散在或数个成群，类梭形、长方形、类三角形或不规则多角形，边缘具突起或稍膨大，直径12～55 µm，长至230 µm，壁厚5～20 µm，孔沟明显，纹孔稀疏，层纹少数可见。韧皮纤维长棒状或长梭形，末端钝圆、平整或钝尖，长80～320 µm，直径20～38 µm，壁厚8～19 µm，孔沟稍密，纹孔少数可见。网纹及螺纹导管直径14～45 µm，有的具网状三生增厚。纤维管胞单个散在或成束，长梭形。见图3。

图3 滇丹参粉末显微图

2.3 薄层色谱鉴别

2.3.1丹参酮ⅡA鉴别

2.3.1.1对照药材溶液的制备取丹参对照药材1 g，加乙醚15 mL，超声10 min，放冷，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作为对照药材溶液。

2.3.1.2对照品溶液的制备取丹参酮ⅡA 对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.3.1.3供试品溶液的制备取本品粉末（过30目筛）1 g，加乙醚15 mL, 超声10 min，放冷，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作为供试品溶液。

2.3.1.4检测方法照薄层色谱法（2015年版《中国药典》四部通则0502）试验，吸取上述对照药材、对照品和供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（6∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，结果见图4。由图可知，供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙红色斑点；供试品色谱与丹参对照药材色谱有明显差异，说明不宜采用丹参对照药材鉴别滇丹参中的丹参酮类成分，故选择丹参酮ⅡA对照品进行定性鉴别。

图4 不同批次滇丹参药材的丹参酮ⅡA薄层鉴别色谱图

2.3.2丹酚酸B鉴别

2.3.2.1对照品溶液的制备取丹酚酸B对照品，加75 %甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.3.2.2供试品溶液的制备取本品粉末（过30目筛）0.4 g，加75 %甲醇25 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。

2.3.2.3检测方法照薄层色谱法（2015年版《中国药典》四部通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯一三氯甲烷一乙酸乙酯一甲醇一甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视，结果见图5。由图可知，供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

图5 不同批次滇丹参药材的丹酚酸B薄层鉴别色谱图

2.4 水分、灰分、浸出物检查 按2015年版《中国药典》方法测定［6］，结果见表2。10批滇丹参中水分含量为12.8 %～14.7 %；总灰分含量为6.5 %～9.4 %；酸不溶性灰分含量为0.7 %～1.6 %；水溶性浸出物含量为26.2 %～45.6 %；醇溶性浸出物含量为9.4 %～14.6 %。建议滇丹参质量标准中水分不得过15.0 %；总灰分不得过10.0 %；酸不溶性灰分不得过3.0 %；水溶性浸出物不得少于25.0 %;醇溶性浸出物不得少于9.0 %。

表2 水分、灰分、浸出物含量测定结果

2.5 含量测定

2.5.1丹参酮ⅡA

2.5.1.1 色谱条件依利特 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇-水（75∶25）为流动相；检测波长270 nm；柱温30 ℃；流量1 mL/min；进样5 μL。色谱图见图6。

图6 丹参酮ⅡA HPLC色谱图

2.5.1.2 对照品溶液的制备精密称取丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇配制成26.4 μg/mL的对照品溶液。

2.5.1.3 供试品溶液的制备取本品粉末（过40目筛）约0.3 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加水10 mL，超声处理5 min，滤过，滤渣与滤纸用水10 mL洗涤，滤干，弃去滤液与洗液，滤渣与滤纸置回同一锥形瓶中，精密加甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5.1.4 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液2、5、8、10、15、20 μL进样，在“2.5.1.1”项下色谱条件测定。以色谱峰峰面积为纵坐标Y，对照品进样量为横坐标X（μg）绘制标准曲线，得回归方程Y=5 980 885X-18 829，r=0.999 7。结果显示样品在0.052 8～0.528 0 μg范围内线性关系良好。

2.5.1.5 精密度试验取对照品溶液5 μL，在“2.5.1.1”项下色谱条件重复测定6次，测得丹参酮ⅡA峰面积RSD为0.65 %，表明仪器精密度良好。

2.5.1.6 重复性试验取同一批样品的供试品溶液5 μL，在“2.5.1.1”项下色谱条件重复测定6次，测得样品中丹参酮ⅡA峰面积RSD为1.25 %，表明该方法重复性良好。

2.5.1.7 稳定性试验将供试品溶液分别于0、1、2、4、8、12 h，在“2.5.1.1”项下色谱条件进样5 μL，测得样品中丹参酮ⅡA峰面积RSD为1.16 %，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.5.1.8 加样回收率精密称取已知含量样品6份，每份1.0 g，各加入1.0mg丹参酮ⅡA对照品，按“2.5.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.1.1”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，丹参酮ⅡA平均回收率为99.47 %（RSD=1.11 %），表明方法的准确度符合要求（n=6），结果见表3。

表3 丹参酮ⅡA回收率试验结果

2.5.1.9 样品含量测定取10批样品，每批约0.3 g，按“2.5.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.1.1”项下色谱条件进行测定，计算含量，结果见表4。建议滇丹参质量标准中含丹参酮ⅡA不得少于0.020 %。

表4 丹参酮ⅡA含量测定结果

2.5.2 丹酚酸B

2.5.2.1 色谱条件依利特 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）为流动相；检测波长286 nm；柱温30 ℃；流量1 mL/min；进样10 μL。色谱图见图7。

图7 丹酚酸B HPLC色谱图

2.5.2.2 对照品溶液的制备精密称取丹酚酸B对照品适量，加75 %甲醇配制成162 μg/mL的对照品溶液。

2.5.2.3 供试品溶液的制备取本品粉末（过40目筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75 %甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，称重，用75 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5.2.4 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液2、5、8、10、15、20 μL进样，在“2.5.2.1”项下色谱条件测定。以色谱峰峰面积为纵坐标Y，对照品进样量为横坐标X（μg）绘制标准曲线，得回归方程Y=876 588X-7 794，r=0.999 9。结果显示样品在0.324～3.240 μg范围内线性关系良好。

2.5.2.5 精密度试验取对照品溶液10 μL，在“2.5.2.1”项下色谱条件重复测定6次，测得丹酚酸B峰面积RSD为0.57 %，表明仪器精密度良好。

2.5.2.6 重复性试验取同一批样品的供试品溶液105 μL，在“2.5.2.1”项下色谱条件重复测定6次，测得样品中丹酚酸B峰面积RSD为1.00 %，表明该方法重复性良好。

2.5.2.7 稳定性试验将供试品溶液分别于0、1、2、4、8、12 h，在“2.5.2.1”项下色谱条件进样10 μL，测得样品中丹酚酸B峰面积RSD为0.88 %，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.5.2.8 加样回收率精密称取已知含量样品6份，每份0.1 g，各加入1.0 mg丹酚酸B对照品，按“2.5.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.2.1”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，丹酚酸B平均回收率为99.65 %（RSD=1.06 %），表明方法的准确度符合要求（n=6），结果见表5。

表5 丹酚酸B回收率试验结果

2.5.2.9 样品含量测定取10批样品，每批约1 g，按“2.5.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.2.1”项下色谱条件进行测定，计算含量，结果见表6。建议滇丹参质量标准中含丹酚酸B不得少于1.50 %。

表6 丹酚酸B含量测定结果

3 讨论

本实验新增建立了滇丹参显微鉴别方法，确定了根横切面和粉末的显微鉴别特征；发现不同硅胶板，不同温、湿度对丹参酮类成分和丹酚酸类成分的薄层色谱鉴别展开效果影响不大，但丹参对照药材不宜用于丹参酮类成分鉴别，故分别选择丹参酮ⅡA对照品对丹参酮类成分进行定性鉴别；在《云南省中药材标准（2005年版）》已有水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物等标准的基础上，补充醇溶性浸出物标准，建议醇溶性浸出物不低于9.0 %；建立了滇丹参中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量测定方法，建议滇丹参质量标准中含丹参酮ⅡA不得少于0.020 %，丹酚酸B不得少于1.50 %。