植物乳杆菌的添加对腌制鲅鱼加工贮藏过程中生物胺的抑制效果研究

◎ 朱容新，何 璇，马 堃，李婷婷

（大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连 116600）

鲅鱼，学名“蓝点马鲛”，肉质细腻嫩滑，味道鲜美，是我国渤海、黄海海域最主要的经济鱼类之一[1]。鲅鱼中富含的脂肪和蛋白质使其具有独特的胶质口感，可制成鱼丸、鱼肝油等多样鱼制品，一直深受消费者喜爱。由于捕捞洄游性鱼类受季节因素影响，且加工贮藏过程中鱼肉极易感染微生物引起腐败变质，因此延长鲅鱼保鲜期至关重要[2]。生物胺（Biogenic Amine，BA）是由微生物在活细胞内氨基酸脱羧过程中产生的天然化合物，大量积累时可引起不良生理效应，如引起人体胃和肠道问题、偏头痛、心悸等现象[3]。食品中组胺是主要形成的胺，其毒性最强，具有直接的致病性和生理毒性，其次是尸胺、酪胺和腐胺，DEL等[4]认为尸胺和腐胺可以增强组胺的毒性，因此生物胺可作为鲅鱼的化学质量指标用于监测食品质量。

植物乳杆菌（L.P）是一种常见的同型发酵乳酸菌，广泛分布在植物、发酵食品和人体中，具有良好的益生效果，因此在食品、医疗、畜牧业等领域被广泛应用[5]。近年来，通过添加发酵剂来抑制不同发酵肉制品中生物胺的积累已有研究。NIE等[6]发现含有植物乳杆菌和酿酒酵母的胺阴性混合发酵剂可降低发酵鲢鱼香肠中的腐胺和尸胺含量。AMONLAYA等[7]将植物乳杆菌作发酵剂接种在泰国发酵猪肉香肠中从而抑制生物胺的积累，提高了发酵香肠的卫生质量。

本实验将植物乳杆菌接种在湿腌法腌制的鲅鱼中，植物乳杆菌可诱导环境快速酸化，从而减少腌制过程中形成的生物胺。考量pH对腌制鲅鱼中细菌生长的抑制性、鱼肉保鲜的各项指标，以及在此过程中生物胺的积累，以期探查植物乳杆菌对腌制鲅鱼中生物胺积累的抑制效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

鲅鱼：购于大连市开发区乐购超市，条重1.0 kg左右；生物胺标准品（色谱纯）：色胺（Try）、腐胺（Put）、尸胺（Cad）、组胺（His）、酪胺（Tyr）；其他试剂（AR）：10.0 mg·mL-1丹磺酰氯丙酮溶液、5%三氯乙酸溶液、正己烷、2.0 mol·L-1NaOH溶液、饱和NaHCO3溶液、氨水、6.0 mol·L-1盐酸溶液、氮气、0.2 mol·L-1盐酸溶液、PCA平板计数琼脂、MRS培养基、0.5 mol·L-1硼酸溶液、0.01 mol·L-1盐酸标准滴定溶液、饱和K2CO3溶液、混合指示剂（甲基红、亚甲基蓝配比为2∶1）、混合氨基酸标准溶液；实验用水均为屈臣氏纯净水。

1.1.2 仪器与设备

LC-20AB型高效液相色谱仪（日本岛津公司）、2010Plus型气相质谱仪（日本岛津公司）、L-8900型高速氨基酸分析仪（日立公司）、HVE-50型高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、T-25型粉碎机（德国IKA）、DHG-9140A型电热鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）、HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）、BR4i型高速冷冻离心机（法国JOUAN）。

1.1.3 样品预处理

将新鲜鲅鱼剔除头尾、内脏和鱼骨，清水冲洗后放入盆中，加入质量为鱼体质量17%的食盐，层鱼层盐涂抹均匀。将鲅鱼分为4组，每组500 g，分别用1×105CFU·g-1、1×106CFU·g-1、1×107CFU·g-13种浓度的L.P悬浮液以及相同体积的无菌生理盐水溶液处理（记：5、6、7、CK）。腌制24 h后取出用清水冲洗脱盐2次，置于烘箱30 ℃烘干，保留鱼体水分约为30%，取出称重并装入自封袋室温待用。在第0 d、4 d、8 d、12 d、16 d、20 d、24 d对腌制鲅鱼进行抽样测定。

1.1.4 实验流程图

研究乳杆菌在鲅鱼腌制过程对生物胺的影响，实验流程见图1。

图1 实验流程图

1.2 检测指标及实验方法

1.2.1 腌制鲅鱼理化指标的测定

（1）pH值的检测方法。参照FAN等[8]的方法，取2.0 g样品于20.0 mL蒸馏水中，搅拌30 min后过滤，滤液备用，用pH计测量。

（2）TVBN的检测方法。参照GB 5009.228—2016食品中挥发性盐基氮的测定中微量扩散法。

（3）菌落总数的检测方法。参照GB 789.2—2016食品微生物学检验中菌落总数测定方法。

1.2.2 腌制鲅鱼生物胺含量的测定

（1）测定方法。参照GB 5009.208—2016食品中生物胺的测定方法。

（2）色谱条件及计算。色谱柱：Waters C18（150 mm×4.6 mm×5 µm，0.01 μm）；柱温40 ℃；流速0.8 mL·min-1；进样量20 µL；紫外检测波长：245 nm；A相纯净水；B相乙腈。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序表

样品中生物胺含量按公式（1）计算：式中：X，样品中生物胺的含量，mg·kg-1或mg·L-1；c，样品溶液中生物胺的浓度，mg·L-1；V，样品溶液体积，mL；f，稀释倍数；m，样品的质量，g。

1.2.3 腌制鲅鱼氨基酸含量的测定

参照GB 5009.124—2016食品中氨基酸的测定。

1.2.4 腌制鲅鱼挥发性风味物质的测定

（1）测定方法。采用李婷婷等[9]的方法，称量2.0 g研碎后的鱼肉放入顶空瓶中，将萃取头（75 μm CAR/PDMS）通过隔膜插入顶空部分，60 ℃水浴条件下吸附40 min后取出，完成萃取过程。将吸附好的萃取头取出，迅速转移至气相色谱进样口内，解析10 min。

（2）气相质谱条件。HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱温40 ℃；进样口温度250 ℃；氦气流速0.81 mL·min-1；解析温度250 ℃；不分离进样；EI源230 ℃；四极杆150 ℃；电离电压70 eV；扫描范围30～550 m·z-1；气相升温程序见表2。

表2 气相升温程序表

1.3 数据分析

所有样品平行测定3次，数据表示为平均值±标准误差。使用IBM SPSS Statistics 26进行数据差异性分析，使用Origin 2019 64Bit对数据绘图分析。

2 结果与分析

2.1 腌制鲅鱼贮藏期间理化指标的变化

2.1.1 腌制鲅鱼pH的变化

腌制鲅鱼pH值的变化如图2所示，在整个加工贮藏过程中pH都呈下降趋势，在24 d时间内CK、5、6、7组分别从初始pH值7.30、6.40、6.20、6.20下降至6.37、6.10、6.10、5.70，其中7组的pH值在第24 d达到最低值。CK的pH下降可归因于鱼肉中的肌糖原发生糖酵解产生乳酸；接种L.P菌种的腌制鲅鱼pH值较CK低可归因于菌种的存在以及菌种代谢产生其他碳水化合物。此结果与NIE等[6]研究植物乳杆菌和酿酒酵母菌接种的鲢鱼香肠中pH的趋势一致。

图2 腌制鲅鱼pH的变化图

2.1.2 腌制鲅鱼TVBN的变化

腌制鲅鱼的腐败水平是通过TVBN值来评价的，由于内源酶和腐败菌会分解鱼肉中蛋白质，产生具有挥发性的氨和胺类物质，因此此类物质含量越高，营养价值越差，通过测定TVBN，可以推测样品的腐败程度[10,11]。腌制鲅鱼在贮藏期间的TVBN值变化如图3所示，CK、5、6、7组的TVBN值均随贮藏时间的延长而增加。其中，TVBN值在0～12 d储存时缓慢增加，但在第12 d后观察到TVBN值显著增加（P＜0.05），这可归因于随着贮藏时间的延长挥发性物质大量积累，促进鱼肉迅速腐败。接种L.P后腌制鲅鱼TVBN的生成受到抑制，增长速度明显慢于对照组，尤其是在第24 d，CK的TVBN值在第24 d为44.33 mg/100 g，而5、6、7组 的TVBN值 较CK分别下降了6.56%、21.05%和42.09%。因此，用1×107CFU·g-1的L.P处理腌制鲅鱼，可得到较好的抑制TVBN增加的效果。这一趋势与石建喜等[12]发酵鲢鱼接种混合发酵剂的研究中TVBN的变化结果一致。

图3 腌制鲅鱼中TVBN的变化图

2.1.3 腌制鲅鱼菌落总数的变化

腌制鲅鱼菌落总数变化如图4所示。在0～12 d的过程中菌落总数计数增加，这可能是由于加工过程中L.P菌种的添加和自然贮藏过程中微生物的生长所致。在急剧上升后，第12 d计数以缓慢的速度开始下降，并最终稳定在较高的水平，这可归因于pH值的下降抑制了部分微生物的生长，鱼肉迅速腐败导致的污染物质的增加以及营养耗尽[13]。CK组的最终计数为7.10 log CFU·g-1，而5、6、7组的菌落总数较CK组分别下降了16.90%、33.10%、34.23%。这可归因于L.P产生抑制其他杂菌生长的细菌素，其中第24 d浓度为107CFU·g-1时的菌落总数4.67 log CFU·g-1，因此接种1×107CFU·g-1的L.P对腌制鲅鱼的菌落总数抑制效果更强。

图4 腌制鲅鱼中菌落总数的变化图

腌制鲅鱼乳酸菌数的变化如图5所示，整体趋势与菌落总数一致，在0～12 d急速上升后计数以缓慢的速度下降，乳酸菌由于其对环境的强适应力和更快的生长速度成为主要的优势微生物。5、6、7组的乳酸菌数均显著高于CK组，因此添加L.P可以促进乳酸菌产生乳酸诱导鱼肉酸化，使鱼肉的pH值大幅下降，从而抑制其他微生物如腐败菌的生长。这与BOVER等[14]的研究结论一致。

图5 腌制鲅鱼过程中乳酸菌数的变化图

2.2 腌制鲅鱼贮藏期间生物胺含量的变化

2.2.1 生物胺检测标准曲线

生物胺单胺的回归方程及相关系数如表3所示。分 别 配 制10 mL 1.0 mg·L-1、2.5 mg·L-1、5.0 mg·L-1、15.0 mg·L-1、25.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1的生物胺标准溶液，采用HPLC对标准液进行分析。以浓度-峰面积绘制生物胺标准曲线，得到3种生物胺的回归方程及其线性相关系数。从表3可以看出，3种生物胺的R2＞0.99。结果表明，该浓度与其峰面积呈良好的线性关系，为计算生物胺含量提供了可靠依据。

表3 生物胺单胺的回归方程及系数表

2.2.2 腌制鲅鱼生物胺的变化

腌制鲅鱼中接种了不同浓度的L.P作为发酵剂培养物，并通过HPLC分析了不同组别中的生物胺含量变化。经过24 d后，如图6（a）所示，CK、5、6、7组尸胺浓度分别从最初的4.85 mg·kg-1、4.26 mg·kg-1、5.20 mg·kg-1、4.95 mg·kg-1增加到27.41 mg·kg-1、25.65 mg·kg-1、23.57 mg·kg-1、20.96 mg·kg-1；5、6、7组中尸胺含量比CK组降 低6.42%、14.01%、23.53%。如 图6（b）所 示，腐胺 浓 度分 别 从最初 的5.64 mg·kg-1、5.84 mg·kg-1、6.51 mg·kg-1、4.08 mg·kg-1增加到25.55 mg·kg-1、22.60 mg·kg-1、20.92 mg·kg-1、18.25 mg·kg-1；5、6、7中腐胺含量比CK组降低11.55%、18.12%、28.57%。如图6（c）所示，组胺浓度分别从最初的4.54 mg·kg-1、4.32 mg·kg-1、4.89 mg·kg-1、4.38 mg·kg-1增 加 到65.79 mg·kg-1、62.22 mg·kg-1、60.99 mg·kg-1、56.34 mg·kg-1；5、6、7中组胺含量比CK组降低5.43%、7.30%、14.36%，这与ESSID等[15]研究生物胺在香肠中高度积累的趋势一致。如图6（d）所示，贮藏过程中接种组的总生物胺浓度明显低于CK组，5、6、7组在第24 d总生物胺含量为110.47 mg·kg-1、105.48 mg·kg-1、95.55 mg·kg-1，均低于CK组118.75 mg·kg-1，分别降低6.97%、11.17%、19.54%，说明接种浓度为1×107CFU·g-1时更能有效地抑制生物胺的积累。

图6 腌制鲅鱼中生物胺含量的变化图

综合各项指标分析，接种L.P腌制鲅鱼pH值降低，导致腐败菌及碱性含氮物质的生成受到抑制，并且抑制胺阳性菌的生长，L.P与其他含有氨基酸脱羧酶的微生物竞争，抑制其生长与脱羧活性从而减少生物胺的积累。此外，L.P含有的生物胺氧化酶可降解贮藏过程中形成的生物胺[16]。

2.3 腌制鲅鱼贮藏期间氨基酸含量的变化

腌制鲅鱼中生物胺的产生与氨基酸的存在有关。如表4所示，发酵24 d后4个浓度批次中的氨基酸含量均显著减少。氨基酸的释放是内源性酶和微生物酶的蛋白水解作用的结果。发酵结束时，CK组氨基酸总量为9.69 mg/100 g，5、6、7组游离氨基酸总量分别为7.28 mg/100 g、15.21 mg/100 g、6.13 mg/100 g。与CK组相比，6中氨基酸含量较高，而5、7中含量较低。导致氨基酸含量的差异可能是由pH值引起的，pH值会影响鲅鱼鱼肉中蛋白质的降解。赖氨酸、鸟氨酸和组氨酸分别是尸胺、腐胺和组胺的前体物质，但L.P抑制了其他含有氨基酸脱羧酶的微生物生长及脱羧酶活性，因此本研究认为游离氨基酸含量与生物胺积累量无显著相关性，影响脱羧酶活性的因素可能比氨基酸更重要。同样，HU等[17]也描述了氨基酸含量和生物胺积累没有显著相关性。

氨基酸影响腌制鲅鱼的营养价值与风味，如表4所示，在第24 d必需氨基酸分别占总氨基酸含量的49.53%、55.63%、50.95%、49.10%，保证适当食用腌制鲅鱼能够对机体摄入氨基酸提供帮助，另外独特的氨基酸风味可中和乳酸引起的酸味，使鱼肉的口感更佳，甜味主要源于苏氨酸和甘氨酸，苦味主要源于甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和精氨酸[18-20]，综上所述，接种浓度为1×107CFU·g-1的腌制鲅鱼甜味较高而苦味酸味较低，具有更丰富的风味。

2.4 腌制鲅鱼贮藏期间挥发性风味物质的变化

腌制鲅鱼过程中挥发性风味化合物的种类及数量如图7所示，通过比较峰面积对风味化合物的变化进行半定量分析。第0 d共检测到136种化合物，其中酸类占比8.82%，酯类占比19.12%，烯类占比14.71%，醇类占比22.06%，酚类占比1.47%，醛类占比33.82%；第24 d检测到88种化合物，其中酸类占比10.23%，酯类占比18.18%，烯类占比11.36%，醇类占比20.46%，酚类占比2.27%，醛类占比37.50%。由图7可以看出，第24 d的风味数量相较0 d较少，整体减少48种，这符合挥发性风味物质的趋势，均为前期鲜味丰富，后期鲜味降低。

图7 腌制鲅鱼中挥发性风味物质的种类及数量图

酸味是挥发性风味物质中一类重要的风味化合物，乙酸作为乙酸酯的前体，被微生物反复利用转化成具有香味的酯类，有助于鲅鱼鱼肉风味的增加[21]。醇类中1-戊烯-3-醇是天然食用香料，天然品主要来源于橙子、草莓等，1-辛烯-3-醇天然存在于薄荷、鲜蘑菇中。烯类化合物通常具有花草香和柠檬香等气味，醛类如己醛、苯乙醛具有青草味及果香味，酚类由于量微不对风味产生影响。由图7可得，醛类是腌制鲅鱼中数量最多的挥发性化合物。其中，己醛、庚醛、（E,E）-2,4-庚二烯醛、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇是主要的鱼腥味来源物质。CK、5、6、7组的鱼腥味物质总量分别为31.21%、9.17%、11.91%、10.4%，其中己醛占鱼腥味物质的41.75%、16.58%、18.72%、8.65%，CK组的己醛含量最高，鱼腥味更重，7中的鱼腥味物质占比最低，证明添加1×107CFU·g-1L.P后对鲅鱼鱼腥味抑制效果最好。

3 结论

本次实验结果表明了腌制鲅鱼加工贮藏过程中3种生物胺的形成，确定了植物乳杆菌添加量与生物胺含量之间的抑制关系。结合各项指标得出结论，当添加植物乳杆菌浓度为1×107CFU·g-1时，pH由于乳酸菌的生长代谢产生乳酸使鱼肉酸化而降低，同时pH的降低抑制其他好氧菌的生长，导致菌落总数减少，由内源酶和腐败菌受到抑制引起的TVBN值降低且鱼肉没有腐烂，生物胺的浓度最低证明1×107CFU·g-1抑制效果最强，同时还保证鱼肉丰富的风味。

因此，1×107CFU·g-1的植物乳杆菌的添加可在最大程度上抑制腌制鲅鱼加工贮藏过程中的生物胺形成，在保证其鱼肉的风味营养与质量的同时，延长腌制鲅鱼的保质期，对腌制鲅鱼防腐保鲜方面具有良好的应用前景。