甲基莲心碱对人下咽癌FADU细胞增殖和凋亡的影响

陈霞 谢红卫 王永鹏 张晓萍 梁卉

【摘要】 目的：探讨甲基莲心碱对人下咽癌FADU细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响及作用机制。方法：分别用不同浓度0μmol/L（CN组）、1μmol/L（LN组）、3μmol/L（MN组）和6μmol/L（HN组）的甲基莲心碱体外干预FADU细胞，倒置显微镜观察细胞形态改变、采用CCK-8法检测细胞增殖的影响，采用Annexin V-FITC/PI双染法检测FADU细胞凋亡的影响。结果：CCK-8法结果显示，与对照组比较，甲基莲心碱用药组可明显抑制人下咽癌FADU细胞增殖，并呈剂量-效应关系（P<0.05）;并可诱导FADU细胞凋亡，随药物浓度增加，细胞凋亡愈明显。结论：甲基莲心碱可体外抑制人下咽癌FADU细胞的增殖、并诱导细胞凋亡。

【关键词】甲基莲心碱;人下咽癌FADU细胞;细胞增殖;细胞凋亡

【中图分类号】R730.4   【文献标识码】A   【文章编号】2026-5328（2021）09--02

甲基莲心碱（Neferine，Nef）是从莲心中提取出来的一种双苄基异喹啉类生物碱，研究表明它具有抗氧化、抗炎、抗抑郁、抗纤维化、抗血小板聚集等作用。近年来研究亦发现，甲基莲心碱在肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞中发挥着重要的抗肿瘤作用。虽然目前甲基莲心碱的抗肿瘤作用研究甚多，但应用于头颈部恶性肿瘤的报道十分少见，本实验采用不同浓度的甲基莲心碱体外干预FADU细胞，观察细胞增殖和凋亡等生物学行为影响，为进一步研究人下咽癌细胞机制提供实验基础。

1.材料

人下咽癌FADU细胞购自中科院生物化学与细胞生物学研究所;甲基莲心碱购自上海源叶生物公司;胎牛血清购自上海四季青公司;DMEM培养液购自美国Hyclone;细胞增殖检测试剂盒（CCK-8）购上海碧云天生物技术有限公司;细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V法）购自上海前尘生物科技有限公司。

2.方法

2.1細胞培养：FADU细胞用10%胎牛血清和1x105U/L青链霉素的DMEM培养液于5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中培养，每2天传代1次，取对数生长期细胞进行观察及下一步研究。

2.2形态学观察：取对数生长期FADU细胞胰酶消化传代后，分成四组，计数以2x105个/mL的密度接种到6孔培养板中，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度0μmol/L（CN组）、1μmol/L（LN组）、3μmol/L（MN组）和6μmol/L（HN组）的甲基莲心碱液进行干预共同培养，24小时后，采用倒置显微镜观察细胞形态的改变。

2.3CCK-8法检测细胞增殖/毒性影响：取对数生长期的肿瘤细胞胰酶消化后，将细胞悬液浓度调至2×104/mL，每孔100μL接种到96孔板中，预培养24小时（37℃，5%CO2），待细胞贴壁后加入10μL四种不同浓度0μmol/L（CN组）、1μmol/L（LN组）、3μmol/L（MN组）和6μmol/L（HN组）的甲基莲心碱溶液进行干预，分别进行0h，24h，48h，72h的分段培养，并在对应时间段加入10μL CCK-8反应液（不生成气泡），孵育1-2h，用酶标仪在450nm处测定吸光度（OD）并记录数值，按公式计算各组增殖抑制率：细胞增殖抑制率（%）=（1-用药组OD/对照组OD）×100%。

2.4Annexin V-FITC/PI双染法检测FADU细胞凋亡的影响：取对数生长期FADU细胞胰酶消化后，密度调至2×105/mL，接种到6孔培养板中，待细胞贴壁后，加入现配的0μmol/L（CN组）、1μmol/L（LN组）、3μmol/L（MN组）和6μmol/L（HN组）甲基莲心碱液干预，48小时后，PBS液洗涤细胞2次，加入5μl V-FITC与5μl Propidium Iodide混匀，室温避光反应10分钟，分别加入400μL 1× Binding Buffer，混匀后置于冰上，1小时内用流式细胞仪定量检测细胞凋亡情况并记录。

2.5统计学处理：采用SPSS20.0软件作统计学处理，实验数据采用用平均数±标准差（±s）表示，组间差异比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1甲基莲心碱干预FADU细胞后的形态学观察：与CN组比较，用药组细胞数量减少，细胞形态皱缩或变形，细胞核皱缩较为明显，细胞膜内陷，并出现触角样改变，随着药物剂量浓度加大，细胞皱缩愈明显。

3.2CCK-8法检测甲基莲心碱对FADU细胞的增殖影响：结果显示，与CN组比较用药组细胞增殖明显受抑制，抑制率差异明显（P<0.05）;不同浓度给药组（LN组、MN组和HN组）组间相互比较，细胞增殖抑制率差异也十分显著（P<0.05），且抑制程度呈现剂量和时间依赖性（见表1）。

4.讨论

人下咽癌（hypopharyngeal carcinoma）属头颈部的恶性肿瘤，占头颈部恶性肿瘤发病率的5-10%[1]，95%以上是鳞状细胞癌，75%以上的患者在医院诊断为下咽癌时均已处于中晚期，大都发生了局部浸润及淋巴结等远处转移，因此下咽癌的预后极差[2]。手术+术后放化疗是目前临床治疗下咽癌的最佳方法，但手术切除病灶作为目前下咽癌的首选治疗方案[3]，术后复发率极高，五年生存率仅不到35%[4]。术后综合放射治疗和化学治疗的方案，可提高生存率，但下咽癌细胞的易侵袭性、易转移性严重影响了下咽癌的治愈率，使其术后复发率及死亡率高居不下。目前下咽癌主要使用顺铂等铂类抗癌药物[5]进行术后的化学治疗，此抗肿瘤药物毒副作用较大，且费用昂贵，因此寻找一种更加有效、安全且经济的方法对于下咽癌患者具有十分重要的临床价值和意义。

甲基莲心碱是一种从植物莲中提取出来的天然药物，研究表明，Nef具有抗炎、抗氧化等作用，另有研究表明甲基莲心碱可通过诱导肿瘤细胞凋亡，阻滞细胞周期和影响肿瘤细胞自噬而发挥抗肿瘤作用，同时可提高化疗的敏感性、降低肿瘤治疗毒性等重要作用。如Nef可通过影响细胞内活性氧（ROS），谷胱甘肽（GSH）等诱导肝癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的增殖[6，7];可通过调节cyclinD等阻滞骨肉瘤细胞周期进程[8]。甲基莲心碱可调节P-gP和 MRP逆转胃癌细胞对长春新碱的耐药性[9];可调节MAPK通路等加强阿霉素对肺癌细胞治疗作用[10];可调节粘着蛋白、波形蛋白等增加奥沙利铂对肝癌细胞的敏感性[11];还可调节线粒体转位等增强化疗药物对乳腺癌的治疗作用[12]。甲基莲心碱在增强抗肿瘤作用的同时，可通过催化自由基的形成降低阿霉素对心脏的毒性[13]，可通过激活MAPK/mTOR信号通路降低顺铂对肾脏的毒性[14，15]。本研究结果表明，甲基莲心碱用药组可明显抑制FADU细胞增殖，随着浓度增加，抑制率也增高;而用药组的细胞凋亡数量较对照组数量高，浓度愈高细胞凋亡愈明显。

总之，甲基莲心碱可抑制人下咽癌FADU细胞的增殖，并诱导细胞发生凋亡，但具体是通过什么信号途径或方式使细胞凋亡，仍需要进一步的研究。

参考文献：

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[11]甲基莲心碱体外抑制人肝癌细胞增殖和侵袭的作用机制研究[J]，中国药理学通报，2016，32（11）：1539-1542.

[12]甲基莲心碱逆转肝癌HepG2/thermotolerance细胞对阿霉素耐受性的作用[J]，癌症，2007，26（4）：357-360.

[13]张永飞，崔久嵬。化疗药物所致心脏毒性的研究进展[J].中国肿瘤临床，2018，45（24）：1243-1247.

[14]杨慧海，王露露，范超等，中药有效成分减轻顺铂肾毒性研究进展[J]。上海中医药杂志，2017，51（5）：98-101.

[15]Li H，Tang Y，Wen l，et al. Neferine reduces cisplaytin-induced nephrotoxicity by enhancing antophagy via the MAPK/Mtor signaling pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，484（3）：694-701.

作者简介：陈霞，1980.10 ，女，汉 ，江西省 萍乡市，硕士 ，讲师 ， 研究方向或从事工作：耳鼻咽喉肿瘤发病机制研究