高效液相直接进样法测定葡萄酒中的苋菜红和胭脂红

◎ 王丽君

（常州市武进区疾病预防控制中心，江苏 常州 213164）

葡萄酒具有良好的保健作用，深受广大消费者喜爱。普通葡萄酒不含人工色素，红葡萄酒的顔色主要来源于葡萄皮中的一种“花青苷”。为增加葡萄酒的色泽，部分商家会添加一些色素来达到效果，尤其是一些市售葡萄酒中常添加胭脂红、苋菜红等合成色素，这些合成色素具有一定的毒性（包括毒性、致泻性和致癌性），其毒性来自合成色素中的砷、铅、铜、苯酚、苯胺、乙醚、氯化物和硫酸盐，对人体均可造成不同程度的危害[1]。目前对合成色素的检测方法有薄层色谱法、示波极谱法、多波长分光光度法和高效液相色谱法等[2-8]。本文在参考国家标准的基础上对高效液相法进行改进，以提高实验准确度。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

高效液相色谱仪（日本岛津LC-10ATvp、SPD10Avp紫外检测器）；色谱柱（CTO-10Asvp），填充物（C18）；超声波振荡器。

甲醇（优级纯），0.02 mol·L-1的乙酸铵（分析纯）。色素标准品：胭脂红GBW（E）100004a（批号：14001）；苋菜红GBW（E）100002a（批号：14001）；除另有说明外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

1.2 方法

1.2.1 标准系列的配置

标准品浓度为0.5 mg·mL-1，加纯水将其稀释至5.0 ng·μL-1作为使用液，用10 μL微量进样针分别于样品中加入标准量为0 ng、12.5 ng、37.5 ng、50.0 ng和75.0 ng，测定，作标准曲线，Y轴截距即为样品中被测物质含量。

1.2.2 样品前处理

样品经0.45 μm滤膜过滤后直接进25 μL样液测定。

1.2.3 色谱条件

色谱柱（CTO-10Asvp），填充物（C18）；柱温40 ℃；流动相为 1.0 mL·min-1，A 为甲醇，B 为0.02 mol·L-1乙酸溶液；进样量为25 μL；检测过程中波长变换见表1，梯度洗脱设置见表2。

表1 波长程序表

表2 梯度洗脱程序表

2 结果与分析

2.1 波长的选定

根据各色素最大吸收波长和元素出峰时间设置时间波长程序可显著提高被测物的灵敏度，《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》（GB/T 5009.35—2016）中要求二极管阵列检测器的波长范围为400～800 nm，紫外检测器检测波长为254 nm。本实验测定时，经紫外检测器扫描，确定苋菜红在0～4 min测定时波长为520 nm，胭脂红在4～11 min测定时波长为510 nm，在此检测条件下，可提高待测物灵敏度，显著减少样品中干扰物质的出峰，且出峰峰形更好。在此条件下，加标样品的高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相葡萄酒加标色谱图

2.2 方法线性范围、回收率、精密度、检测限

在2.1实验条件下，得苋菜红的线性回归方程为y=2 057.7x+1 348.8，R2=0.999 0，胭脂红的线性回归方程为y=2 004.7x-69.21，R2=0.999 2。线性关系良好，相关系数在0.999以上，方法的加标回收率分别为95%和102%，相对标准偏差（RSD）为5.86%和6.84%，检测限分别为 0.024 mg·L-1和 0.087 mg·L-1。

3 讨论

3.1 波长程序的设定

每次开机测量时，各组分的保留时间会发生变化，因此，每次实验前根据各组分的保留时间选择合适的混合标准溶液以校正波长程序。在本实验中，以国家标准为参考，根据样品的自身特点选择合适的波长和波长程序。当样品分析的组分较多，基体较为复杂时波长程序的设定更为必要。

3.2 双峰定量优化

直接进样法测定时样品基体复杂，色素在酒中可能会有部分转化为其他物质。实验中发现，加标法中苋菜红的标准曲线用双峰（即图1中的峰1和峰2的峰面积之和）组合作标准曲线时其线性更好，其回归方程的线性相关系数r=0.999 6，而单峰的相关系数为R2=0.999 0，经双峰定量曲线计算，回收率为102.05%，经单峰定量曲线计算，回收率为103.76%，表明双峰定量具有一定的优化性。

3.3 不同前处理方法比较

经实验发现，去除酒中的乙醇可减少苋菜红在酒中的转化物。经过赶乙醇处理的样，其回收率明显减小。但由于国家标准中没有明确规定去除乙醇的时间和温度，因此，在确保乙醇不挥干的基础上进行测试，发现待测物质仍有大量损失。由于葡萄酒中乙醇蒸发所需的时间较难控制，再加上损失的不确定性，省略蒸发这一操作步骤，回收率可得到优化，具体检测情况见表3。因此，本实验采取直接进样法进行测定。

表3 葡萄酒不同前处理加标回收率及精密度表

3.4 标准加入法与标准曲线法结果比较

在本实验条件下，发现同一样品采用标准曲线法与标准加入法进行定量，测得的结果存在差异，标准曲线法测得的样品平均浓度低于标准加入法。标准曲线法测得样品加标回收率为79.12%～88.23%，标准加入法测得的加标回收率为89.32%～103.76%，标准加入法测得的加标回收率明显高于标准曲线法，则可证明标准加入法测得的结果更为准确。由于食品类样品基体一般较为复杂，但待测物含量低，对实验结果干扰较大，因此选择标准加入法进行测定，准确度相对较高。

3.5 聚酰胺吸附

本次实验按照国家标准进行色素提取，发现用聚酰胺进行吸附后，用解吸液解吸，聚酰胺上的色素难以完全洗脱，其标准回收率为75.43%～85.16%，低于直接进样法。因此本实验采用直接进样标准加入法，可省去烦琐的前处理步骤，提高方法的准确度，减少有机溶剂对环境和人员的危害。

3.6 曲线回归比较

经实验发现，对分别浓度配制法和一瓶浓度递增法进行曲线回归比较，其结果差距相对较小。分别浓度配制法：分别吸取混合标准使用液2.5 μL、7.5 μL、10.0 μL、12.5 μL于10 mL容量瓶中，用样品液定容后测定。一瓶浓度递增法：准确移取2.5 μL标准使用液于10 mL容量瓶中，用样品液定容至10 mL，混匀，取25 μL进样测定，即得除空白外的第1点的色谱图，向容量瓶内加5.0 μL标准使用液，混匀后测定为第2点，同此法分别加入2.5 μL，得第3点和第4点，即得与分别配制法相同的浓度系列。一瓶浓度递增法使用的实验器具较少，减少了操作步骤，简单方便，对于原子吸收、气相色谱、质谱仪等大型精密仪器均可参考使用。

4 结论

本文参照国家标准对葡萄酒中苋菜红、胭脂红进行测定，解决了实际操作中遇到的一系列问题，对测试条件、样品处理、数值的定量进行合理改进，提高方法精密度和准确度，可应用于酒类样品中人工合成色素的测定。