核桃分心木水提物抗疲劳作用研究

侯登勇 张建 何颖 罗群

摘 要：目的：研究核桃分心木水提物的抗疲劳作用，为其保健品开发和应用提供科学依据。方法：制备分心木水提物并测定其总多糖、总多酚和总黄酮含量。将小鼠随机分为空白对照组和分心木水提物低、中、高剂量组，连续灌胃14 d，测定小鼠的体重、脏器指数和负重游泳力竭时间，检测血清乳酸（BLA）、乳酸脱氢酶（LDH）、尿素氮（BUN）、肌肉和肝脏糖原含量，以及肝脏丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果：分心木水提物得率为（9.41%±0.82%），总多糖、总多酚、总黄酮含量分别为（33.40%±0.88%）、（30.80%±2.28%）、（24.62%±0.86%）。分心木水提物对小鼠的体重和脏器指数没有明显影响（P>0.05），能延长小鼠的负重游泳力竭时间（P<0.01），并具有剂量依赖性，能降低小鼠BLA和BUN含量，提高LDH活性（P<0.01）。与空白对照组相比，给药组小鼠运动后肝、肌糖原含量增加，肝脏MDA含量降低、SOD活性升高（P<0.01）。结论：分心木水提物能提高小鼠的运动耐力，具有抗疲劳作用。

关键词：核桃;分心木;水提物;小鼠;抗疲劳

分心木是核桃中夹在核桃仁之间的木质小薄片，体轻、质脆、易折断[1-2]，颜色呈棕色或棕褐色，味苦涩，性平，入脾、肾经，具有固肾涩精功效，可以治疗遗精、遗尿、多汗、泻痢以及失眠多梦等多种疾病[3-4]。药理活性研究表明，分心木除具有补肾作用外，还具有抑菌、抗氧化等作用[5]。然而，人们食用或加工核桃时往往只利用了核桃仁，同时产生的大量分心木除了在少部分地区被用来泡茶喝外，绝大部分都被作为废弃物处理，造成资源的极大浪费[6]。分心木的进一步开发应用对提高核桃附加值，减少浪费具有重要意义。

疲劳可导致肌肉力量和耐力下降、运动技能表现下降、身体和心理功能下降等[7]，不仅会影响人们的日常活动，还可能会导致一些疾病的发生[8]。分心木能够改善睡眠，固肾涩精，但目前尚未看到关于分心木抗疲劳方面的研究报道。本实验研究了分心木水提物对小鼠负重游泳时间、负重游泳后BLA、BUN含量和LDH活性的影响，测定了肝、肌糖原及肝脏MDA含量和SOD活性，为分心木在抗疲劳方面的保健品开发和应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料與试剂

分心木，购自云南楚雄;肝糖原、肌糖原、BLA、BUN、LDH、MDA和SOD检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所;芦丁和没食子酸标准品，购自中国食品药品检定研究院;其他试剂，均为国产分析纯。

1.2 实验动物

Balb/c小鼠（合格证编号：20130016006241），雄性，体质量18～22 g，SPF级，购自海军特色医学中心动物中心。

1.3 仪器与设备

TB-214型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;JT502N型计重电子秤，上海精天电子仪器有限公司;5418R型台式冷冻离心机，德国Eppendorf公司;759型紫外-可见光分光光度计，上海奥谱勒仪器有限公司;354型酶标仪，美国Thermo公司;Lyolab-3000型真空冷冻干燥机，奥地利Heto-Hotten公司。

1.4 方法

1.4.1 分心木水提物的制备 称取分心木1 000 g，用蒸馏水清洗干净，加入10 L蒸馏水，浸泡2 h后，100 ℃加热回流提取，提取时间为60 min。收集提取液，过滤，用旋转蒸发仪60℃左右浓缩至200 mL，-70℃预冻6 h，-50℃真空冷冻干燥48 h，即得分心木水提物（AED）。

1.4.2 分心木水提物总黄酮含量测定 精确移取浓度为0.1 mg/mL分心木水提物溶液1 mL，置25 mL 的容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min;加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min;加4%氢氧化钠溶液4 mL，加水稀释至刻度线，摇匀，放置15 min，在波长500 nm处测定吸光度，根据标准曲线（标准品为芦丁）计算出样品中总黄酮含量。

1.4.3 分心木水提物总多酚含量测定 精确移取浓度为0.1 mg/mL分心木水提物溶液1 mL，加入5.0 mL FolinCiocalteu试剂中，反应4 min 后，加入4.0 mL 75 g/L 的Na2CO3 溶液，置室温下反应120 min，于760 nm 下测定吸光度。根据标准曲线（标准品为没食子酸）计算总多酚的含量。

1.4.4 分心木水提物总多糖含量测定 精确移取浓度为0.1 mg/mL分心木水提物溶液1 mL，加入0.5 mL 6%苯酚溶液和5 mL 浓硫酸，沸水浴中加热15 min 后冷却，于490 nm下测定吸光值。根据标准曲线（标准品为葡萄糖）计算样品中总多糖的含量。

1.4.5 动物分组及给药 Balb/c小鼠80只，雄性，根据体重随机分为4组，每组20只，分别为空白对照组 （CG）、低剂量组 （LDG）、中剂量组（MDG）、高剂量组（HDG）。CG组以生理盐水灌胃，LDG组剂量为125 mg/kg，MDG组剂量为250 mg/kg，HDG组剂量为500 mg/kg。各组小鼠每天称重，灌胃给药，0.1 mL/10 g，连续14 d。各组小鼠在灌胃期间自由取食和饮水[9]。

1.4.6 小鼠负重游泳实验 每组随机挑选10只小鼠，于末次灌胃2 h后，在小鼠尾巴根部负荷8%体重的铅皮，放入水池中游泳，水深30 cm，水温25.0℃，如出现漂浮水面休息的情况，则不断用玻璃棒拨动小鼠强迫游泳，直到力竭为止。记录自游泳开始至头部全部沉入水中 10 s不能浮出水面的时间为小鼠负重游泳力竭时间。休息10 min后，颈椎脱臼处死，解剖取肝脏、肾脏、心脏和脾脏，称重，计算各脏器指数。

1.4.7 小鼠血清生化指标检测 各组剩余的10只小鼠，末次灌胃2 h后，在小鼠尾巴根部负荷3%体重的铅块，放入水池中强迫游泳，游泳20 min后，取出小鼠，烘干体表水分。放回原笼休息10 min后，摘眼球取血，4℃放置4 h后2 500 r/min 离心，取血清，按试剂盒说明书测定BLA、BUN、LDH含量。

1.4.8 小鼠肝、肌糖原和肝组织中MDA含量和SOD活性的测定 将取血后的小鼠颈椎脱臼处死。取肝脏和股四头肌组织各200 mg，加入2 mL生理盐水进行匀浆，以4 000 r /min离心10 min 后取上清液。按试剂盒说明书测定肝糖原、肌糖原含量和肝组织中MDA含量和SOD活性。

1.4.9 数据分析 数据以均数±标准误差（±s）表示，采用软件SPSS 18进行单因素方差分析，P <0.05 为差异显著、P<0.01为差异非常显著。

2 结果与分析

2.1 分心木水提物主要成分含量测定

经水提、浓缩、真空冷冻干燥后得深褐色分心木水提物，提取率为（9.41%±0.82%）。按方法部分所述测定分心木水提物中的总黄酮、总多糖和总多酚含量。结果显示，分心木水提物中总黄酮含量为（33.40%±0.88%）、总多糖含量为（30.80%±2.28%）、总多酚含量为（24.62%±0.86%）。

2.2 分心木水提物对小鼠体重和脏器指数的影响

如表1所示，3个给药组小鼠的体重与空白对照组相比无明显变化（P>0.05）。表2所示，各组小鼠的肝脏、心脏、肾脏、脾脏和胸腺的脏器指数统计学分析没有明显差别（P>0.05），这表明分心木提取物对小鼠体重和脏器没有明显影响。

2.3 分心木提取物对小鼠负重游泳时间的影响

末次灌胃2 h后，小鼠负重游泳，记录游泳时间，结果如图1所示。与空白对照组相比，分心木提取物低中、高剂量都能显著提高小鼠的负重游泳时间（P<0.01），且具有一定的剂量依赖性，说明分心木水提物能够增加小鼠的负重游泳时间，提高小鼠的抗疲劳耐受力。

2.4 分心木水提物对小鼠BLA、LDH和BUN的影响

小鼠游泳20 min，休息10 min后，眼球取血測定血清乳酸和尿素氮浓度以及乳酸脱氢酶的活性。如表3所示，3个剂量组小鼠的BLA含量都非常明显低于空白对照组（P<0.01）。与空白对照组相比，低、中、高剂量组小鼠血清乳酸脱氢酶活性均明显升高（P<0.01）。3个剂量组小鼠BUN含量与空白对照组相比，分别下降了17.21%、25.05%、31.82%，具有统计学意义（P<0.01）。

2.5分心木提取物对小鼠肝糖原和肌糖原的影响

小鼠负重游泳后处死，取肝脏和肌肉组织，匀浆后按试剂盒说明测定糖原含量，结果如表4所示。分心木水提物给药组小鼠体内的肝糖原和肌糖原含量都比空白对照组小鼠非常明显增多（P<0.01），表明分心木水提物能提高小鼠肝脏和肌肉组织中的糖原储备量，提供更多的能量，从而增加小鼠的运动耐力。

2.6 分心木水提物对小鼠肝脏组织中MDA含量和SOD活性的影响

肝脏组织匀浆后，按试剂盒说明书测定MDA含量和SOD活性，结果如表5所示。与空白对照组比较，分心木水提物给药组小鼠肝脏组织中MDA的含量非常明显降低（P<0.01）。3个剂量组小鼠肝脏组织中的SOD活性均非常明显高于空白对照组小鼠（P<0.01）。结果说明分心木水提物能够提高小鼠的抗氧化能力。

3 讨论

研究表明，分心木中含有黄酮[9-12]、多糖[13]和多酚类[14]物质。本研究中分心木的水提物提取率为9.4%，与文献报道一致[11]。分心木水提物中总黄酮的含量为33.40%，低于文献报道中60%乙醇提取物中的含量42.19%[15]，原因可能是黄酮在乙醇溶液中的溶解度大于水溶液。分心木水提物中总多糖与总多酚含量分别为34.91%和24.62%，与文献报道基本一致[14，16]。每天灌胃给于小鼠分心木水提物14 d后，各组小鼠的体重没有明显差异，说明分心木水提物对小鼠的正常饮食没有影响。各组小鼠的脏器指数没有明显差别，说明分心木水提物在给药剂量范围内不会对小鼠各脏器产生不利影响。文献报道分心木水提物的小鼠急性毒性LD50为21.5 g/kg[17]，而本研究的最高剂量为0.5 g/kg，为LD50的2.32%，是非常安全的。负重游泳力竭时间是反映小鼠运动耐力的最直观的指标，与机体的抗疲劳能力呈正相关[18-19]。分心木水提物能够明显延长小鼠的负重游泳力竭时间，提高小鼠的抗疲劳能力。机体剧烈运动时所需能量主要由无氧代谢供给，无氧代谢过程中会产生大量乳酸，血液中乳酸含量和清除乳酸的乳酸脱氢酶活性是评价机体疲劳和抗疲劳能力的重要指标[20]。血尿素氮含量可反映蛋白质分解代谢和对运动耐受性的程度，当疲劳产生时尿素氮含量也随之增加[21]。肝糖原是一个反应疲劳状态较敏感的指标。剧烈运动时，肌糖原消耗不断增加，肝糖原储备减少以维持血糖水平[22]。本研究结果显示，分心木水提物能明显降低小鼠血清乳酸含量，增加血清中乳酸脱氢酶的活性，降低小鼠血清尿素氮含量，提高小鼠体内的肝、肌糖原含量，具有明显的抗疲劳效果。

剧烈运动会使体内产生大量的超氧阴离子自由基和活性氧，与DNA、蛋白质和细胞膜等生物大分子反应，生成脂质过氧化物（MDA），造成细胞结构的破坏，使机体功能下降并产生疲劳感。SOD是体内清除超氧阴离子自由基和活性氧的最重要的酶。分心木水提物能够明显增加小鼠肝脏中的SOD活性，降低MDA含量，提高小鼠的抗氧化能力，这可能是分心木提高小鼠抗疲劳能力的主要机理之一。另外，分心木具有催眠安神和固肾涩精的功效，可能也是其具有抗疲劳作用的重要原因。◇

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Anti-fatigue Activity Study of Aqueous Extract from Diaphragma juglandis Fructus in Walnut

HOU Deng-yong，ZHANG Jian，HE Ying，LUO Qun

（Navy medical center of PLA，Shanghai 200433，China）

Abstract：Objective To determine the anti-fatigue activity of aqueous extract from Diaphragma juglandis Fructus （AED）in walnut，and set base for further application of the extract.Method Diaphragma juglandis Fructus was extracted with water under reflux.The extracting liquid was concentrated and lyophilized.The total polysaccharides，polyphenol and flavonoid in AED were measured.Mice were randomly divided into control group，low dose AED group，middle dose AED group and high dose AED group.After AED was orally administered to mice continuously for 14 days，the body weight，organ index，load swimming time，blood lactic acid （BLA），blood urea nitrogen （BUN），serum lactate dehydrogenase （LDH），hepatic and muscle glycogen，hepatic malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）activity of the mice were measured to evaluated the anti-fatigue effect of AED.Result The yield rate of the lyophilized AED was （9.41%±0.82%）.The total polysaccharides，polyphenol and flavonoid in AED were （33.40%±0.88%），（30.80%±2.28%） and （24.62%±0.86%） differently.There was no difference among the groups about body weight and organ index（P>0.05）.AED could prolong the exhaustive swimming time，lower the content of BLA and BUN，increase serum LDH activity（P<0.01）.Compare to the control group，hepatic and muscle glycogen，hepatic SOD activity of the mice in the three dose groups after exercise increased，while hepatic MDA content decreased（P<0.01）.Conclusion AED could increase endurance capacity of physical exhaustion and had anti-fatigue activity.

Keywords：walnut;Diaphragma juglandis Fructus;queous extract;mice;anti-fatigue