线粒体丝氨酸蛋白酶抑制MPTP诱导小鼠帕金森病的研究*

李小双，太颢然，苏炳银△，李淑蓉

1.成都医学院 发育与再生重点实验室(成都 610500)；2.成都医学院 人体解剖与组织胚胎学教研室(成都 610500)；3.成都医学院 病理学与病理生理学教研室(成都 610500)

帕金森病(Parkinson's disease, PD)是世界第二大神经退行性疾病[1]，其病理表现为中脑黑质多巴胺能神经元变性，出现静止性震颤、肌强直、运动迟缓、平衡障碍等[2]。研究[3]认为，PD是由多种风险和致病因素(遗传和环境因素)导致的多因素疾病。目前PD治疗手段单一，传统的替代治疗虽可一定程度减轻症状，但需长期甚至终生用药。长期药物治疗易诱发神经、消化、心血管系统等不良反应，严重影响PD患者生活质量。

线粒体丝氨酸蛋白酶(high temperature requirement A2，HtrA2/Omi)正常情况下定位在线粒体双侧膜结构之间，通过折叠错误、剪切和清除变性蛋白，维持线粒体结构和功能稳定；在线粒体受损和通透性增加的情况下，HtrA2/Omi能够被释放到细胞质，通过含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)依赖性和非依赖性机制促进细胞死亡[4-5]。HtrA2/Omi在神经系统中起着重要的保护作用，HtrA2/Omi失活的mnd2小鼠和HtrA2/Omi敲除小鼠表现出黑质纹状体的多巴胺能神经元丢失和PD样症状[6-7]。在部分PD患者中，检测到HtrA2/Omi突变[8]。HtrA2/Omi激活还受PD相关激酶PINK1介导的HtrA2/Omi磷酸化的调控[9]。此外，PD的发生与氧化应激密切相关[10--11]。有研究[12]证明，HtrA2/Omi参与了细胞的应激过程，发挥了细胞保护作用。研究[13]表明，过表达HtrA2/Omi的细胞在对过氧化氢应激时可增强细胞抵抗。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)的代谢产物1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridin-1-iuM iodide，MPP+)通过多巴胺转运蛋白被转运到神经元的线粒体中，导致线粒体功能障碍使多巴胺能神经元丢失[14]，多巴胺能神经元的丢失或变性是PD的主要病理改变，因此，MPTP常被用于PD的动物模型构建。为进一步验证HtrA2/Omi的体内效应，本研究通过腹腔注射MPTP构建PD小鼠模型[15-16]，尾静脉注射腺相关病毒AAV9-HtrA2/Omi过表达HtrA2/Omi，观察过表达HtrA2/Omi的小鼠体内应激反应，探索过表达HtrA2/Omi小鼠在MPTP诱导下PD模型小鼠中多巴胺能神经元的改变。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 12月龄雄性C57BL小鼠16只，体重(32.0±1.8)g，随机分为生理盐水组(5只)、MPTP组(5只)和MPTP+HtrA2/Omi组(6只)。动物饲养采用清洁级标准，每周更换1次垫料、饮水。实验动物的处理与操作均严格按照国际卫生研究机构的伦理指南进行，通过成都医学院动物实验伦理委员会批准，实验动物均在麻醉下进行，以减少其疼痛。

1.1.2 实验试剂 MPTP购自美国Sigma公司，GAPDH(ab8245)多克隆抗体、HtrA2/Omi(ab75982)单克隆抗体购自英国Abcam公司，酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)(25085)、α突触核蛋白(AB5038)购自德国Merck公司，AAV9-HtrA2/Omi(48262-1)腺相关病毒(每只5×108vg/L)，购自上海吉凯基因，胎牛血清购自美国Gibco公司，改进型柠檬酸钠抗原修复液购自江苏碧云天公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物模型 MPTP+HtrA2/Omi组小鼠注射AAV9-HtrA2/Omi腺病毒载体，注射前使用灭菌后PBS稀释病毒，每只小鼠注射病毒量约2×108vg/L，注射后观察0.5 h。在注射病毒2周后，MPTP组和MPTP+HtrA2/Omi组小鼠按每只20 mg/kg腹腔注射MPTP，构建PD小鼠模型，生理盐水组用等量生理盐水作为对照，1次/d，连续注射2周。

1.2.2 行为学检测 HtrA2/Omi注射2周后，对小鼠进行转棒实验和爬杆实验。1)转棒实验：在MPTP注射前3 d，对小鼠进行转棒实验训练，计时1 min，转棒速度从0开始逐步加速到30 r/min，记录小鼠在棒时间(s)，每次结束后休息1 min，重复训练5次。每次记录前1 d按上述方法训练小鼠，每隔1周记录1次，每次记录在同一时间段进行，连续记录3次。2)爬杆实验：将直径为2 cm塑料小球固定于1根长60 cm、粗1 cm的木杆顶端，木杆上缠绕2层纱布，防止打滑。使小鼠四爪接触木杆顶端，松手，开始计时，记录小鼠从顶端滑到底部的时间(s)，每次记录在同一时间段进行，连续记录3次。

1.2.3 小鼠脑组织绿色荧光检测 MPTP+HtrA2/Omi组小鼠在尾静脉注射腺相关病毒AAV9-HtrA2/Omi过表达HtrA2/Omi 4周后，取3组小鼠脑组织，进行固定、脱水、包埋、冰冻切片，干燥箱37 ℃烘片1 h，烘干后PBS洗3次，每次10 min，含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，在BX-63正置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表达。

1.2.4 小鼠组织免疫荧光检测 用4% PFA灌注，取小鼠脑组织进行固定、脱水、包埋、冰冻切片。选3组小鼠同一层面的中脑组织切片，干燥箱37 ℃烘片1 h，烘干后PBS洗3次，10 min/次，在电磁炉中用改进型柠檬酸钠抗原修复液进行抗原修复，煮沸20 min，自然冷却至室温，PBS洗3次，用950 μL PBS、50 μL马血清、5 μL 0.5% TritonX-100配制的封闭液，4 ℃封闭1 h，一抗工作液4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，10 min/次，常温下二抗避光孵育2 h，PBS洗3次，10 min/次，含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，镜下观察。

1.2.5 组织蛋白免疫印迹实验 用新加入1%PMSF的RIPA裂解液裂解新鲜组织收集蛋白样品，用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)法测定蛋白浓度，取20 μg蛋白加入适量的1× SDS-PAGE上样缓冲液，加入10%丙烯酰胺凝胶进行电泳。垂直电泳溴酚蓝燃料到达底部后，50 V恒压冰浴转膜2 h，用含5%脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline tween-20，PBST)室温封闭1 h，PBST漂洗10 min，一抗稀释液稀释的一抗工作液4 ℃孵育过夜，PBST洗3次，10 min/次，常温下二抗孵育2 h，PBST漂洗3次，每次10 min/次。电化学发光液(electrochemiluminescence，ECL)按A液∶B液=1∶1配制，滴于PVDF膜上，成像显影。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠行为功能检测

生理盐水组、MPTP组和MPTP+HtrA2/Omi组间小鼠在棒时间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。随着MPTP注射时间的增加，MPTP组小鼠在棒时间逐渐缩短，表明持续腹腔注射MPTP导致小鼠出现行为功能障碍。MPTP+HtrA2/Omi组0周时小鼠在棒时间明显低于生理盐水组和MPTP组；随着MPTP注射时间延长，MPTP+HtrA2/Omi组小鼠在棒时间逐渐增加，第2周时，生理盐水组小鼠在棒时间高于MPTP组，MPTP+HtrA2/Omi组小鼠在棒时间高于MPTP组，表明HtrA2/Omi的表达可改善小鼠因MPTP导致的运动能力减退(表1)。

表1 3组小鼠转棒实验结果

C57BL雄性小鼠在开始注射MPTP药物时，生理盐水组和MPTP组小鼠爬杆时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；随着MPTP注射时间的延长，MPTP组小鼠爬杆时间较生理盐水组小鼠缩短(P<0.05)；而在MPTP+HtrA2/Omi组小鼠中，持续MPTP注射后小鼠爬杆时间先出现短暂下降后又出现增加，表明HtrA2/Omi可改善小鼠因MPTP导致的行为能力障碍(表2)。

表2 3组小鼠爬杆实验结果

2.2 小鼠脑组织GFP表达

3组小鼠脑组织GFP结果显示，生理盐水组和MPTP组未检测到GFP，MPTP+HtrA2/Omi组中观察到GFP荧光，表明小鼠在注射腺相关病毒AAV9-HtrA2/Omi第4周后，HtrA2/Omi在小鼠脑组织中成功表达(图1)。

图1 3组小鼠中脑组织GFP表达

2.3 过表达HtrA2/Omi对MPTP所致中脑黑质多巴胺能神经元的作用

3组小鼠在腹腔注射MPTP 2周后，检测各组同一层面的脑组织切片TH免疫荧光，MPTP组小鼠中脑多巴胺能神经元TH阳性细胞较生理盐水组小鼠明显减少，MPTP+HtrA2/Omi组小鼠中脑多巴胺能神经元TH阳性细胞数多于MPTP组，但少于生理盐水组。对3组中脑组织蛋白免疫印迹检测发现，MPTP可使TH蛋白表达量减少，而过表达HtrA2/Omi后，可减轻MPTP导致的TH蛋白减少，表明过表达HtrA2/Omi后，可减缓MPTP导致的小鼠中脑多巴胺能神经元的减少，缓解因MPTP导致的TH蛋白表达的减少(图2、表3～4)。

图2 3组小鼠中脑多巴胺能神经元检测

表3 3组小鼠中脑多巴胺能神经元TH阳性细胞免疫荧光结果(个，

表4 3组小鼠中脑组织TH与GAPDH灰度值比值结果

2.4 过表达HtrA2/Omi对α突触核蛋白的作用

用免疫荧光检测3组小鼠脑组织同一层面切片中α突触核蛋白聚集情况显示，MPTP组小鼠中脑α突触核蛋白聚集多于生理盐水组，MPTP+HtrA2/Omi组小鼠中脑α突触核蛋白聚集少于MPTP组，但多于生理盐水组。在长时间MPTP诱导的小鼠PD模型中，小鼠中脑α突触核蛋白聚集增多，MPTP+HtrA2/Omi组小鼠α突触核蛋白比MPTP组减少，表明过表达HtrA2/Omi可减轻MPTP所致中脑α突触核蛋白聚集(图3、表5)。

图3 3组小鼠中脑组织α突触核蛋白免疫荧光

表5 3组小鼠中脑组织α突触核蛋白免疫荧光结果(个,

3 讨论

PD是仅次于阿尔茨海默病的世界第二大神经退行性疾病，多发于老年人，随着年龄增加其发病率成倍增加[1,17]。PD起病隐匿，早期较难诊断，对于缓慢进展者则可表现出静止性震颤、运动迟缓、肌张力升高等表现，临床较易诊断。目前以左旋多巴、抗胆碱能药物、金刚烷胺等多巴胺前体等替代治疗作为PD的首选治疗。PD患者需长期乃至终生服药，而长期用药容易造成神经、消化、心血管系统等不良反应[18-19]。很多口服药物难以通过血脑屏障，因此PD治疗很难获得理想疗效，因而探索潜在的治疗途径和靶点，对PD患者治疗疾病、改善临床症状，提高生活质量有重要意义。研究[20-21]表明，HtrA2/Omi突变可能与PD等神经退行性疾病有关，在HtrA2/Omi活性缺失的mnd2小鼠中，可出现神经退行性改变。为验证HtrA2/Omi在PD中的效应，利用腺相关病毒AAV9-HtrA2/Omi构建HtrA2/Omi过表达小鼠；同时以MPTP腹腔注射构建小鼠PD模型，观察HtrA2/Omi对PD中脑黑质多巴胺能神经元的影响，旨在发现潜在的临床治疗思路。

本研究结果表明，HtrA2/Omi过表达后小鼠未出现明显异常情况，通过检测AAV9-HtrA2/Omi荧光，提示HtrA2/Omi过表达模型构建成功。在MPTP腹腔注射构建PD小鼠模型时，小鼠未出现死亡，但在MPTP注射后小鼠出现行为能力减弱，进一步比较生理盐水组、MPTP组、MPTP+HtrA2/Omi组MPTP注射2周后的情况，发现HtrA2/Omi过表达小鼠在活动能力(爬杆实验、转棒实验)方面较MPTP组有一定改善。在对3组同一位置层面的中脑多巴胺能神经元进行TH免疫荧光检测发现，MPTP组出现TH阳性神经元明显减少，而HtrA2/Omi的过表达减轻了中脑多巴胺能神经元的大量丢失。α突触核蛋白在许多神经变性疾病中发挥重要作用，α突触核蛋白是α突触核蛋白聚合物的重要组分，是PD的病理特征之一。3组中脑多巴胺能神经元染色细胞计数统计显示，生理盐水组与MPTP组、MPTP+HtrA2/Omi组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；且MPTP组与MPTP+HtrA2/Omi组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明HtrA2/Omi过表达的小鼠可减缓因MPTP所致中脑黑质多巴胺能神经元的大量丢失，起到神经保护作用。3组小鼠脑组织α突触核蛋白聚集检测发现，生理盐水组α突触核蛋白聚集明显低于MPTP组、MPTP+HtrA2/Omi组，且过表达HtrA2/Omi的小鼠中，α突触核蛋白聚集少于MPTP组，对3次不同重复试验相同面积脑组织α突触核蛋白免疫印迹点进行计算统计也发现，3组差异均有统计学意义(P<0.05)，且MPTP组与MPTP+HtrA2/Omi组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明过表达HtrA2/Omi后可减少因MPTP诱导的PD小鼠中α突触核蛋白的聚集[22-23]。

综上所述，在MPTP诱导的PD模型小鼠中，过表达HtrA2/Omi可减少中脑多巴胺能神经元的丢失，减轻脑组织中α突触核蛋白的聚集，可一定程度改善小鼠行为能力。