卵巢上皮癌CD24和Yes相关蛋白1的表达及其临床意义

刘鑫路，吴运萍△，张林海，何 瑶，邵启祥

1.连云港市第二人民医院 输血科(连云港 222006)；2.南京医科大学附属医院 妇科(南京 210004)；3.江苏大学医学院 免疫学教研室 (镇江 212013)

卵巢癌在妇科恶性肿瘤中发病率位居首位，是威胁女性健康的头号杀手[1-2]。卵巢癌一般在发病初期不易被察觉，疾病早期的病理特征较隐匿，因此造成漏诊，当患者到医院就诊时已处于疾病晚期，此时行手术治疗很难达到理想效果[3]。研究[4]显示，细胞黏附分子CD24在癌症产生和发展中发挥重要作用。有研究[2-7]显示，黏附分子 CD24除表达于人体的正常组织外，恶性肿瘤的发生、发展与CD24的异常高表达有明显相关性。研究[6-7]表明，CD24 在很多恶性肿瘤中有不同程度的异常表达，可能与肿瘤的发生发展机制有一定相关性，CD24是卵巢癌干细胞标志和卵巢癌的治疗靶点。

Yes相关蛋白1 (YAP1)属于转录辅助因子，是Hippo-YAP抑癌信号通路中非常重要的效应分子，在肿瘤的调控中发挥着至关重要的作用[8]。研究[8-16]发现，YAP1与多种肿瘤因子共同促进肿瘤细胞在人体的进一步发展。截至目前尚无明确的分子生物学原理阐释卵巢癌的发生发展机制，也无CD24和YAP1二者同时在卵巢上皮癌表达情况的相关文献报道。本研究通过采用免疫组化等技术检测CD24和YAP1二者在卵巢癌上皮性组织中的表达情况，并分析二者参数与卵巢癌预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选择2013年6月至2017年6月在连云港市第二人民医院进行切除术治疗的卵巢癌患者的卵巢组织样本为研究对象，采集44例卵巢癌患者的癌组织样本，同时采集上述患者的正常卵巢组织标本进行对照研究。入组的卵巢癌患者未进行放、化疗，且相关病理数据齐全。基于国际妇产科联合会相关标准进行卵巢上皮癌分期判断。通过苏木精-伊红染色法 (HE) 对采集的全部标本进行染色处理，由2个经验丰富的主任医师开展复查工作，提高诊断准确性。

1.2 主要材料

兔抗人CD24单克隆抗体(购自美国Phygene Biotechnology Co，稀释浓度1∶200)；兔抗人YAP1多克隆抗体(购自美国PhygeneBiotechnology Co，稀释浓度1∶400)；免疫组化检测试剂(购自北京金豪制药股份有限公司)；免疫组化封闭液和相应的试剂盒(来源于北京康药科技)。

1.3 免疫组化

将蜡块按厚度4 μm做连续切片，采用免疫组化免疫酶标方法进行检测，使用试剂商推荐的确定含该蛋白的阳性组织作为阳性对照，以磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)设置相应阴性对照。对采集的样本在显微镜下400倍观察，各切片选5个视野，各视野内确定出100个细胞。观察结果发现，细胞膜和细胞质中都出现染色后的CD24信号，而YAP1的信号大部分出现在细胞质中。染色后这两种蛋白都表现为黄色颗粒状，浓度高则颜色越深。在肿瘤组织中观察到黄色颗粒，则判断为阳性染色，基于其中阳性染色细胞数的占比进行表达水平划分：不表达(-)、<10%(+)、10%～50%(++)、>50%(+++)。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，基于Spearman法验证相关性，组间差异进行方差检验，多组数据差异进行Bonferroni对比，基于Kaplan-Meier检测，检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 在病理特征有差异的卵巢上皮性组织中CD24和YAP1二者的表达情况

2.1.1 CD24的表达情况 通过对病理特征有差异的卵巢组织免疫组化检测结果表明，正常组织中CD24含量很少，而在卵巢癌组织中表达高，差异具有统计学意义(P<0.05)。在正常样本中，CD24的表达水平低于癌组织的情况主要出现在细胞膜上，同时相应的阳性程度低(+)；卵巢癌组织中，CD24主要出现在细胞膜和细胞质中，表现为强阳性，阳性率也高于正常组织(表1、图1)。

表1 CD24在不同性质卵巢组织中的表达情况(n=44)

图1 CD24在不同卵巢组织中的表达

2.1.2 YAP1的表达情况 正常卵巢组织中，YAP1的表达水平均不高，但在卵巢上皮癌组织中高表达，组间差异有统计学意义(P<0.05)。正常卵巢组织中，YAP1单纯出现在细胞质中；而在卵巢上皮癌组织中，其还出现在细胞核中。阳性水平结果显示，正常卵巢组织中YAP1一般表现为弱阳性，卵巢上皮癌组织中则为强阳性(表2、图2)。

表2 YAP1在两种卵巢组织中的表达(n=44)

图2 YAP1在不同卵巢组织中的表达

2.2 多组性质不同的参数与卵巢癌上皮性组织中CD24和YAP1表达的相关性

2.2.1 CD24的表达与不同临床参数的关系 在卵巢上皮癌组织中，CD24蛋白表达水平和肿瘤分级、分期等相关指标均存在密切关系，具体表现为分期高、分化低的癌组织中CD24含量更高，但其表达水平和淋巴结转移及患者的年龄等不存在相关性(表3)。

表3 CD24在不同临床病例特征的卵巢上皮癌的表达情况

2.2.2 YAP1水平和临床参数的关系 在卵巢上皮癌组织中，YAP1蛋白的表达水平高，同时受到样本量等因素的影响，在研究过程中没有确定出临床参数和其表达水平的关系(表4)。

表4 YAP1在不同临床病例特征的卵巢上皮癌的表达情况

2.3 CD24、YAP1蛋白表达的相关性

CD24阳性的32例患者中，YAP1也为阳性的31例；CD24阴性的12例中，只有1例YAP1也为阴性。卵巢上皮癌组织中，以上两种蛋白的表达呈正相关(r=0.501，P=0.035)。

2.4 CD24和YAP1的表达与卵巢癌患者预后的关系

数据收集至2017年6月，同时对入选的44例患者进行随访，随访截至2019年12月，有12位患者生存，32位患者死亡。采用Kaplan-Meier法分析入组患者的存活时间发现，CD24和YAP1二者皆阳性的表达组存活周期明显低于非同时表达阳性组的存活周期(表5、图3)。

表5 患者术后随访情况(n)

图3 CD24和YAP1的表达与卵巢癌患者预后的关系

3 讨论

卵巢癌在妇科恶性肿瘤中发病率位居首位，是威胁女性健康的头号杀手[1-2]。尽管近期出现一些治疗卵巢癌的新方法，但因卵巢自身的特殊结构以及早期相关症状不易被发现的特点，给早期诊断带来了困难，当临床发现时大部分患者已错失最佳治疗期[9-10]。

研究[11]发现，CD24可协助肿瘤的诊断，作为一种新的指标可应用于临床实践中，且在不同肿瘤细胞表面存在不同程度的高表达，该指标也可指导肿瘤的预后[12]。有研究[13]提出，在肿瘤判断方面，CD24有较高的指示价值，可作为一种高效标志物，其表达水平高的患者预后一般较差，且对卵巢癌患者的预测价值更高。

研究[14-15]表明，YAP1在卵巢癌的调控机制上起到非常重要的作用，对癌细胞的相关组织有一定的诱导作用。多项研究[14-17]提出，YAP1在多种肿瘤中高表达，YAP1的表达水平和肿瘤患者的生存期存在密切关系。

Touboul等[17]研究发现，CD24和YAP1都有一定程度表达，来源于肿瘤细胞的外体可表达出肿瘤的特异性及共同的抗原。目前国际主流研究[18]认为，外体具有相应的抗肿瘤作用，其可作为一种载体搭载抗原并将其运输到抗原呈递细胞，从而激发机体的特异性免疫反应达到抗肿瘤目的。上述研究均肯定了二者在上皮癌组织中起到的作用。

本研究发现，在卵巢上皮癌组织中CD24和YAP1表达水平和正常卵巢组织相比明显增高(P<0.05)；CD24的表达水平与病理分期、分化等相关，CD24和YAP1的表达呈正相关，经Kaplan-Moier检测发现，与其他组患者相比，癌组织中这两种蛋白同步表达阳性情况下，患者生存期会明显降低(P<0.05)。以上结果提示，CD24、YAP1和卵巢上皮癌相关，二者同时阳性可作为卵巢上皮癌患者预后不良的标志。

综上所述，CD24、YAP1 蛋白在上皮性卵巢癌组织中呈现高表达，并与卵巢上皮癌临床分期及年龄、淋巴结转移等都存在一定相关性，提示CD24、YAP1 蛋白在卵巢上皮癌的发生和发展中发挥一定作用。因此进行临床诊断时，可同步检测CD24与YAP1的表达，从而对卵巢上皮癌的状况进行判断，且预测其增殖、侵袭相关情况，在此基础上进行演变机制的研究，可为卵巢上皮癌患者的分子靶向治疗起到一定促进作用，并提供可靠支持。但由于本研究纳入样本量较小，卵巢上皮癌的发生和演化过程中，这两种蛋白的作用机制尚不明确，需要开展大样本研究，更好地满足临床应用要求。