血清LTD4在非酒精性脂肪性肝病诊断中的临床意义*

孙立平，朱继宝，孙立珍

(首都医科大学密云教学医院:1.感染性疾病科;2.检验科，北京 101500)

目前，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在全世界的发生率逐渐升高，影响了全世界约1/4的人群[1]，严重危害了公众健康。NAFLD包括一系列肝脏疾病，从非酒精性脂肪肝(NAFL)到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，最终可能导致肝硬化和肝细胞癌[2]。从2015年到2030年，美国NAFLD患者预计将增加21%，从8 310万例(2015年)增加到1.009亿例(2030年)，NASH患者数将从1 652万例增加到2 700万例[3]。NASH是由脂肪积累而造成肝细胞损伤，同时伴有肝脏炎症形成的疾病,其典型特征是肝脏组织学上的改变，包括脂肪变性、小叶炎症、伴或不伴窦周纤维化的气球样变[1]。细胞膜磷脂发生病理、生理改变时可出现花生四烯酸(AA)的氧化物；AA经脂氧合酶(LOX)代谢途径后产生的物质包括白三烯(LT)；LTD4作为炎性趋化因子中作用最强的半胱氨酰LT分子，是由AA经5-LOX途径代谢生成的一类重要炎症介质[4]。研究已经证实，LTD4在原发性肝癌中会过度表达[4]，同时作为重要的炎症介质，参与了多种炎性反应过程。当NAFLD患者肝脏发生炎性反应时，是否也有LTD4的表达呢？目前有关检测NAFLD患者体内LTD4的报道较少见。本研究分析了NAFLD患者血清LTD4水平变化情况。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年9月至2020年6月本院肝病门诊NAFLD患者46例作为研究对象，根据疾病类型将其分为NASH组(25例)和NAFL组(21例)。同时选取15例健康志愿者作为对照组。诊断标准：符合《非酒精性脂肪肝性肝病诊疗指南(2010年修订版)》诊断标准。排除标准：各种肝炎、自身免疫性疾病、糖尿病等可能影响LTD4水平的疾病。3组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组一般资料比较

1.2方法 于清晨空腹状态下抽取静脉血5 mL至未加抗凝剂的红头管内，经离心后，留取血清1 mL，并置于-80 ℃冰箱保存。将标本送至本院检验科检测谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)。血清LTD4采用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测，检测试剂盒由上海研谨生物科技有限公司提供，严格遵照试剂盒操作说明书进行。(1)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度标准品50 μL；(2)样本孔先加待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL，空白孔不加；(3)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min；(4)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；(5)每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；(6)每孔加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定各孔的吸光度值。

2 结 果

2.13组ALT、AST水平比较 3组ALT、AST水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。NASH组ALT、AST水平均高于NAFL组和对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 3组ALT、AST水平比较

2.23组血清LTD4水平比较 NASH组血清LTD4水平为(676.86±74.01)ng/mL，明显高于NAFL组和对照组的(462.20±54.51)、(475.11±38.51)ng/mL，差异有统计学意义(P<0.05)。NAFL组血清LTD4水平与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3血清LTD4诊断效能分析 血清LTD4诊断NASH的曲线下面积为0.996(95%CI为0.987～1.000，P<0.001)。见图1。

图1 ROC曲线

2.4LTD4水平与ALT、AST水平相关性分析 在NASH患者中，LTD4水平与ALT、AST水平无相关性(r=0.115、0.090，P>0.05)。

3 讨 论

目前，全球NAFLD发生率可达25%，其中59%会进展为NASH[5]，而且NAFLD可直接导致失代偿期肝硬化和肝细胞癌，严重危害人类健康[6]。NASH患者发生肝硬化的概率是单纯性脂肪变的11倍[7]。研究表明，与健康人群相比，NAFLD患者平均寿命缩短4～10年，主要与NAFLD所导致的恶性肿瘤、心脑血管事件发生风险升高有关[8]。近年来对于NAFLD的发病机制还未完全阐明，越来越多的NASH相关肝损害研究指出，细胞因子和炎性因子介导肝脏的慢性炎性反应[9]。LTD4是花生四烯酸在白细胞中代谢后的产物，不仅直接参与了炎症过程的调控，而且还具有调控细胞增殖、分化等功能[10]。

NASH是NAFLD的活动形式，是发生慢性肝病并发症的最大风险。ALT与AST分别存在于肝细胞和肝细胞的线粒体中。循环血液中ALT与AST的水平升高说明肝细胞发生炎性坏死，肝细胞内的ALT、AST溢出细胞外进入血液循环，导致了外周血液中ALT、AST水平升高。本研究结果显示，NASH组ALT、AST水平明显高于NAFL组和对照组。提示NASH患者具有肝细胞损伤。有研究发现，免疫相关炎症的变化在NAFLD的发病机制中起着非常重要的作用[11]。NASH患者肝细胞发生了炎性反应，会产生很多重要的炎症介质，而LTD4就是其中之一。本研究结果显示，3组血清LTD4水平比较，NASH组最高，且NAFL组和对照组血清LTD4水平无明显差异。提示NASH患者体内LTD4呈高水平表达状态，其参与了NASH患者肝脏的炎性反应。LTD4是某些变态反应及炎症疾病中的化学介质，在机体出现炎性反应时，LTD4水平会显著提高[12]。肝脏的炎性反应主要是由浸润的炎性细胞，如单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等，以及大量促炎性细胞因子和趋化因子共同作用的结果。LT由LTB4和半胱氨酰(包括LTC4、LTD4和LTE4)组成。肝脏的Kupffer细胞、肥大细胞和内皮细胞也可以产生LT，而且在肝内LTC4经过LTD4代谢为LTE4，而肝实质细胞是否合成LT目前尚不清楚。LTD4作为重要的炎症介质，一方面可能引发肝细胞损伤，促进癌变；另一方面，在炎症的加剧方面扮演了重要的角色。

本研究结果显示，血清LTD4诊断NASH的曲线下面积为0.996。提示LTD4在NASH的诊断中具有重要意义。此外，本研究结果还显示，LTD4水平与ALT、AST水平无相关性，这与张继舜等[12]研究结果不一致，与ZHOU等[13]研究一致。体外实验发现，LTD4在细菌内毒素及病毒的协同作用下可导致肝细胞损害[14]。而NAFLD与原发性肝癌没有这些诱因。同时，有研究发现，单纯LTD4仅对肝细胞造成轻度损伤，但其又可显著促进D-氨基半乳糖的肝细胞毒性作用，从而诱发急性肝损害[14]。因此，在NASH患者血清中，LTD4水平升高的原因可能为肝细胞内的脂质经氧化应激后导致肝细胞损伤，继而发生的炎性反应导致了LTD4水平升高，同时高水平LTD4又可导致肝细胞损伤[12-13]。LTD4对肝细胞的损伤程度不一，因此NASH患者LTD4水平的高低与患者肝功能水平没有明显关系，其在血清中的表达量不能判断肝细胞损伤情况。LTD4是否对病情的发展及预后尤其是对肝癌的进展有意义仍需进一步研究。

综上所述，NAFLD患者肝脏发生炎性反应时，即NAFLD进展为NASH时，患者体内LTD4水平会显著升高，这对NASH的诊断及评估具有重要意义。但是LTD4与肝硬化和肝癌的进展是否有关系，还需要大量的临床样本和分子生物学的实验来进一步证实。