基于双相动力学分析靶向药物联合应用对肝癌细胞SNU-387 增殖的影响及其作用机制

刘畅，裴晋红，穆秀丽，于保锋

1.长治医学院基础部生物化学与分子生物学教研室，山西长治046000；2.山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，山西太原030001

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞对大多数细胞毒性药物不敏感，因此，普遍认为HCC 是一种化疗抗性肿瘤［1-2］。目前，索拉非尼（sorafenib）、瑞戈非尼（regorafenib）和乐伐替尼（lenvatinib）已经FDA 批准用于治疗 HCC 晚期患者［3-5］，这 3 种药物均是血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）抑制剂，通过抑制血管新生发挥作用，但由于患者的耐药性和不耐受性，其临床应用受到明显限制。

HCC 发生发展涉及一系列复杂的信号通路（包括高度激活的RAS-BRAF-MEK-ERK（MAPK）和PI3K ／Akt ／ mTOR 信号通路）及受体酪氨酸激酶的异常表达［3］。癌细胞内含有诸多能驱动癌症发生发展的突变，但并不是针对每种突变的治疗方案都取得了成功，如 BRAF 抑制剂针对 BRAF V600E ／ K 突变的黑色素瘤效果显著，但对携带相同BRAF V600E 突变的结直肠癌和甲状腺癌无效［6］。BRAF 是MAPK 通路成员之一，能够调控细胞增殖、分化及其他细胞反应［7］。HCC 组织中有 BRAF V600E 突变，但癌旁正常组织中无该突变，表明BRAF V600E 突变具有肿瘤特异性［8］。携带BRAF 突变的HCC 患者恶化率更高，表明 BRAF 突变是 HCC 治疗的潜在靶点［8］。Src 激酶在多种癌细胞的增殖、存活、黏附、侵袭和迁移过程中发挥重要作用［9］，Src 激酶抑制剂在多种实体肿瘤的临床实验中治疗效果不佳［10-12］，推测Src 可能只是多驱动增殖癌细胞中的增殖驱动基因之一。联合使用靶点不重合的抑制剂可能对肿瘤治疗产生强协同效应，如dasatinib 是一种针对 Src、Abl、PDGFR 和c-Kit 的酪氨酸激酶抑制剂，已用于治疗费城染色体阳性白血病、对imatinib 有抗药性的慢性粒细胞白血病及多种实体瘤［13-15］。前期研究表明，联合使用Src 抑制剂dasatinib 和BRAF 抑制剂PLX-4720 可协同抑制乳头状甲状腺癌和间变性甲状腺癌细胞的增殖和迁移，还可增加免疫细胞的浸润，减小体内肿瘤体积［16-18］。

大多数癌细胞是多驱动增殖，药物的实际抑制作用在低浓度范围内比单靶点动力学拟合曲线预测效果好，而在高浓度范围则相反，因此药物抑制细胞活力50%时的浓度（IC50）不能准确反映多驱动增殖癌细胞对激酶抑制剂的反应。双相动力学公式对抑制数据的拟合程度更好，比单靶点动力学公式计算结果低5 ~ 10 倍，可更好地表明细胞与药物之间的相互作用［12］。本研究分别采用单靶点和双相动力学公式分析肝癌细胞SNU-387 对11 种酪氨酸激酶抑制剂的反应，通过观察拟合曲线的适应度和残差平方和（the sums of squared residues，SSR），比较两种公式分析细胞-药物相互作用的有效性，分析药物联合使用对SNU-387 细胞增殖和信号通路的影响，为药物进一步临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 人 HCC 细胞系 SNU-387（STR 鉴定正确）购自中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂 dasatinib、BMS-754807、AZD6244、AZD6482、BGJ-398、bosutinib、crizotinib、gefitinib、imatinib、sunitinib 购自美国 Selleck Chemicals 公司；HG6-64-1 购自美国 MedChemExpress 公司；RPMI1640 培养基购自美国HyClone 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国 Gibco 公司；MTT 和 DMSO 购自北京索莱宝生物有限公司；兔抗Src、磷酸化Src（p-Src）、MEK1 ／ 2、磷酸化 MEK（p-MEK）、ERK1 ／ 2、磷酸化 ERK（p-ERK）、PDK1、磷酸化 PDK1（p-PDK1）、AKT、磷酸化 AKT（p-AKT）、IRβ、磷酸化 IRβ（p-IRβ）、IGF-1Rβ、磷酸化 IGF-1Rβ（p-IGF-1Rβ）、BRAF、p-BRAF单克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology 公司；小鼠抗GADPH 单克隆抗体、HRP 标记的羊抗兔IgG 和羊抗鼠IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL 发光试剂检测试剂盒购自北京康为世纪有限公司。

1.3 细胞培养 用含10% FBS 的 RPMI1640 培养基，将 SNU-387 细胞于 37 ℃，5% CO2的培养箱中培养3 ~ 5 d，传代，取第3 代细胞进行后续试验。

1.4 SNU-387 细胞对酪氨酸激酶抑制剂敏感性的检测 采用MTT 法。将SNU-387 细胞，按1×103个／孔加入96 孔板37 ℃孵育24 h；弃培养基，加入11种酪氨酸激酶抑制剂（AZD6244、AZD6482、BGJ398、BMS-75-4807、bosutinib、crizotinib、dasatinib、gefitinib、imati-nib、sunitinib、HG6-64-1），每种抑制剂均设10 nmol ／ L、100 nmol ／ L、1 μmol ／ L 和 10 μmol ／ L 4 个浓度，200 μL ／孔，继续培养 72 h；加入 5 mg ／ mL的 MTT，50 μL ／ 孔，37 ℃避光孵育 4 h；弃 MTT，加入DMSO，200 μL ／ 孔，37 ℃振荡培养 10 min，使紫色结晶完全溶解；用酶标仪检测A490和A750，计算细胞存活率（1 - 细胞抑制率）。每个试验至少重复3次。经10 μmol ／ L 酪氨酸激酶抑制剂处理后的细胞抑制率超过50%时，将相应抑制剂从20 μmol ／ L 进行倍比稀释至 0.6 nmol ／ L，共 16 个浓度，按上述方法检测，并计算IC50。

1.5 单靶点动力学分析 将BMS-754807、dasatinib和 HG6-64-1 3 种酪氨酸激酶抑制剂从 20 μmol／L 倍比稀释至 0.6 nmol／L，作用于 SNU-387 细胞，37 ℃培养72 h 后，同1.4 项方法检测并计算IC50，按下式计算相对抑制率，以抑制剂浓度的对数为横坐标，细胞相对存活率（1 - 相对抑制率）为纵坐标，绘制单靶点动力学曲线。以IC50作为变量，将实验测得的细胞活力（1 - 相对抑制率）与公式所得细胞活力（通过动力曲线获得）之间的 SSR 最小化［12］，根据最小 SSR 计算出的IC50对曲线的适应度最好，为最佳IC50。SSR是使用Microsoft Excel 中的Solver 程序计算所得。

1.6 双相动力学分析 同1.5 项方法培养细胞及计算IC50，并按下式计算相对抑制率，以抑制剂浓度的对数为横坐标，细胞相对存活率（1 - 相对抑制率）为纵坐标，绘制双相动力学曲线。以F1、Kd1和Kd2作为变量，将实验测得的细胞活力（1 - 相对抑制率）与公式所得细胞活力（通过动力曲线获得）之间的SSR最小化［12］，根据最小 SSR 计算出的 F1、Kd1和 Kd2为最佳拟合参数。

式中F1是细胞中对抑制剂的敏感相，Kd1是F1相细胞的Kd，F2是细胞中对抑制剂的不敏感相，Kd2是F2相细胞的Kd，公式要求F1+ F2= 1。

1.7 酪氨酸激酶对信号通路影响的检测 用BMS-754807、dasatinib 和 HG6-64-1 3 种酪氨酸激酶抑制剂稀释为2 倍IC5（0浓度分别为1、3、1.5 μmol ／ L），分别作用于SNU-387 细胞，于37 ℃培养3 h，同时设对照组（不进行药物处理）。经RIPA 裂解液提取SNU-387 细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。取 60 μg 蛋白，经 12% SDS-PAGE 分离后，转移至 PVDF 膜，用5%脱脂奶粉于室温封闭1 h；用TBST 洗涤3 次，分别 加入兔抗 Src、p-Src、MEK1 ／ 2、p-MEK、ERK1 ／ 2、p-ERK、PDK1、p-PDK1、AKT、p-AKT、IRβ、p-IRβ、IGF-1Rβ、p-IGF-1Rβ、BRAF、p-BRAF 单克隆抗体（均 1 ∶1 000稀释）和小鼠抗GAPDH 单克隆抗体（1 ∶2 500 稀释），4 ℃孵育过夜；用TBST 洗涤 3 次，加入 HRP 标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠 IgG（均 1 ∶2 500 稀释），37 ℃孵育 1 h；ECL 显影。

1.8 药物联合使用对SNU-387 细胞增殖影响的检测将 BMS-754807、HG6-64-1 和 dasatinib 3 种酪氨酸激酶抑制剂进行倍比稀释，共16 个稀释度（20 ~0.6 nmol／L），加入 SNU-387 细胞，于 37 ℃处理 72 h；按1.4 项方法计算IC50及IC70，并根据Chou-Talalay公式［19］计算减量指数（dose reduction index，DRI），以评价药物组合与单药比较，达到相同抑制水平减少药物浓度的倍数［19-20］。

2 结 果

2.1 SNU-387 细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性经 10 μmol／L 抑制剂处理后，SNU-387 细胞抑制率超过50%的蛋白激酶抑制剂有AZD6244、BGJ-398、BMS-754807、bosutinib、crizotinib、gefitinib、imatinib、sunitinib和 HG6-64-1，见图 1。SNU-387 细胞对 BMS-754807 和HG6-64-1 比较敏感，IC50分别为（0.934 ± 0.030）和（0.730 ± 0.142）μmol ／ L；对 1 μmol ／ L 的 dasatinib比较敏感，高浓度dasatinib 反而促进SNU-387 细胞增殖，IC50难以确定；对imatinib 不敏感。因此，选择BMS-754807、dasatinib、HG6-64-1 进行后续试验。

图1 蛋白激酶抑制剂对SNU-387 细胞增殖的影响Fig.1 Effect of protein kinase inhibitors on proliferation of SNU-387 cells

2.2 单靶点动力学分析 BMS-754807 抑制SNU-387细胞的IC50［（0.934 ± 0.030）μmol ／ L］比实际抑制率达50%时的浓度高。dasatinib 浓度高1 μmol ／ L时反而促进SNU-387 细胞增殖，IC50难以确定，单相公式拟合曲线的SSR 达1.369，拟合度不佳，药物的实际抑制作用与最佳拟合曲线不符；在低浓度范围内，抑制剂的实际抑制作用比最佳拟合曲线更有效。HG6-64-1 抑制 SNU-387 细胞的 IC50为（0.730 ±0.142）μmol／L，SSR 为 0.033。见图 2。表明单靶点动力学曲线并不能准确反映细胞经药物处理的变化。

图2 SNU-387 细胞经蛋白激酶抑制剂处理后的单靶点动力学分析结果Fig.2 Single-target kinetic analysis of SNU-387 cells treated with protein kinase inhibitors

2.3 双相动力学分析 BMS-754807、dasatinib 和HG6-64-1 对 SNU-387 细胞F1相增殖抑制作用显著。BMS-754807 处理 SNU-387 细胞的 F1约为37%，表明BMS-754807 抑制37% SNU-387 细胞的增殖，Kd1为（5.1 ± 1.7）nmol ／ L，比IC50［（0.934 ±0.030） μmol ／ L］更准确地反映 BMS-754807 和SNU-387 之间的关系；F2约为63%，表明其他细胞对该抑制剂不敏感，Kd2=（7.1 ± 1.3）μmol ／ L（ >5 μmol／L）。dasatinib 抑制约 40%SNU-387 细胞的增殖，Kd1为（3.9 ± 1.9）nmol ／ L，双相公式拟合曲线的拟合度优于单相公式，SSR 降低约24 倍。HG6-64-1 抑制约 57% SNU-387 细胞的增殖，Kd1为（252 ±82）nmol ／ L，抑制另外 43%细胞增殖，Kd2为（2.8 ±0.6）μmol ／ L，由于两条拟合曲线的 SSR 相似，尚未明确SNU-387 细胞对HG6-64-1 的反应是单相还是双相。见图3。

图3 SNU-387 细胞经酪氨酸激酶抑制剂处理后的双相动力学分析结果Fig.3 Kinetic analysis of SNU-387 cells after treatment with tyrosine kinase inhibitors

2.4 酪氨酸激酶对信号通路的影响 BMS-754807 能够部分抑制IR 磷酸化，完全抑制Ser473 位点Akt磷酸化。dasatinib 能够完全抑制Y416 位点Src 磷酸化，也能够抑制 Y527 位点 Src 磷酸化，5 μmol ／ L dasatinib 能够激活Erk 磷酸化，与2.1 项结果一致。HG6-64-1 能够显著抑制Mek 磷酸化，但不能完全抑制Mek 磷酸化，推测有BRAF 同基因家族基因CRAF或ARAF 等其他形式存在，使Mek 激活。见图4。

图4 Western blot 法检测酪氨酸激酶抑制剂对信号通路的影响Fig.4 Analysis of effect of tyrosine kinase inhibitors on signaling pathways of SNU-387 cells by Western blot

2.5 药物联合使用对SNU-387 细胞增殖的影响BMS-754807 与dasatinib 联合使用的协同抑制效果不显著；BMS-754807 与HG6-64-1 联合使用的IC50和 IC70分别为（195 ± 6）和（442 ± 7）nmol ／ L，均显著低于单独使用时的IC50和IC70，50%抑制率时，DRI 约为 2 倍以上，表明 BMS-754807 与 HG6-64-1联合使用的效果约为单药处理的2 倍。HG6-64-1 和dasatinib 联合使用抑制细胞活力50%时，效果是单药处理的 5 倍。见图 5。BMS-754807、HG6-64-1 和dasatinib 联合使用的 IC50和 IC70分别为（15 ± 1）和（42±3）nmol／L，均显著低于每种药物单独使用或两药组合的 IC50和 IC70，当 3 种药物浓度均 >0.3 μmol／L时，SNU-387 细胞的活力几乎被完全抑制。见表1。

图5 酪蛋白激酶联合使用对SNU-387 细胞增殖的影响Fig.5 Synergistic inhibitory effect of combination of tyrosine kinases on proliferation of SNU-387 cells

表1 酪氨酸激酶抑制剂联合作用SNU-387 细胞后的IC50 和IC70（nmol ／ L）Tab.1 IC50 and IC70 values SNU-387 cells after combined treatment with tyrosine kinase inhibitors（nmol ／ L）

3 讨 论

SNU-387 细胞基因组包含676 个编码突变，包括 EGFR 突变（V819V），Pik3ca 突变（L735L）和NRAS 突变（Q61K）。本研究检测SNU-387 细胞对11种酪氨酸激酶抑制剂的反应，结果表明，Src、Akt 信号通路和MAPK 信号通路对于驱动SNU-387 细胞增殖仅发挥部分作用，提示在SNU-387 细胞中这3条信号通路均发挥重要作用。其中，dasatinib 是一种广谱的多靶点（包括 Src、Abl 和 PDGFR 等）蛋白酪氨酸激酶抑制剂，SNU-387 细胞对约 1 μmol ／ L dasatinib 比较敏感，但对高浓度dasatinib 不敏感；imatinib 是Abl 的有效抑制剂，但SNU-387 细胞对imatinib 不敏感，因此dasatinib 抑制的靶点不是Abl。

SNU-387 细胞对 BMS-754807、dasatinib 和 HG6-64-1 的反应说明了双相分析的意义和局限。BMS-754807 是一种 IR ／IGF-1R 抑制剂［21-22］，对 SNU-387 细胞的抑制作用非常符合双相动力学公式，该药物抑制约 37%SNU-387 细胞的增殖，Kd1为（5.1 ±1.7）nmol／L。BMS-754807 也可抑制其他63%细胞的增殖，但Kd2高达（7.1 ± 1.3）μmol ／ L，这是该药物对 SNU-387细胞的脱靶效应或毒性。由于dasatinib 浓度高于1 μmol ／ L 时反而促进 SNU-387 细胞增殖，dasatinib对该细胞的抑制作用既不遵守单靶点动力学公式，也不遵守双相动力学公式。但由双相分析结果可知，dasatinib 显著抑制约40%SNU-387 细胞的增殖。HG6-64-1 是一种 BRAF 抑制剂［23］，SNU-387 细胞对HG6-64-1 的反应表明了双相动力学分析的另一个局限，两种计算方法拟合的曲线非常相似，难以判断SNU-387 细胞对HG6-64-1 的反应是单相还是双相，可是 Kd为（0.730 ± 0.142）μmol ／ L 的单相反应，也可是 Kds分别为（252 ± 82） nmol ／ L 和（2.8 ±0.6）μmol ／ L 的双相反应（57% ／ 43%）。因此，当 F1和F2的Kds相差约10 倍时，较难区分药物对细胞是单相还是双相抑制；当两者相差100 倍或更多时，拟合曲线明显不同。对于大多数药物，Kd1和Kd2相差越大，双相分析越有意义。

双相分析为评估多驱动增殖癌细胞对靶向治疗的反应提供了新的框架，双相分析也能够解释为何有些蛋白激酶抑制剂在实验室被证明有效，但临床上收效甚微，如Src 已被证明在多种癌症发生发展中发挥重要作用［9］，但Src 抑制剂在临床上表现并不佳［10-11］。推测可能是由于Src 只是多驱动增殖癌细胞中的一个驱动因素，因此，单独使用Src 抑制剂并不能有效抑制癌细胞增殖。据文献报道，尚无癌症或细胞系能仅由Src 驱动增殖，在SNU-387 细胞中，Src 可能也只是增殖驱动因素之一。dasatinib 处理 SNU-387 细胞的 IC50低于 1 μmol ／ L，因此可得出结论dasatinib 能有效抑制SNU-387 细胞增殖。但由于dasatinib 对SNU-387 细胞的影响包括靶点特异性和脱靶毒性，如dasatinib 在不依赖于毒性时，对SNU-387 细胞的抑制率低于50%（约为40%）。

多驱动增殖细胞对某一激酶抑制剂的反应是两种作用的混合，即低Kd（nmol ／ L 级）的靶点特异性抑制F1相和高Kd（μmol ／ L 级）的脱靶毒性F2相。一方面，几乎所有的抑制作用均发生于F1相；另一方面，IC50不能准确反映细胞对药物的反应，SSR 值较高，单靶点动力学公式计算出的最佳拟合IC50值通常与目测拟合曲线推测值不同，因此，F1和Kd1能够更准确地反映细胞-药物相互作用。敏感的靶点特异性抑制（F1相）是靶向治疗的基础，不敏感的脱靶毒性可能会限制靶向治疗的有效性［12］。在单基因驱动增殖细胞中，F1相就能完全抑制细胞增殖，不受毒性限制，对于SNU-387 细胞来说，F1相仅能部分抑制细胞增殖，若想使用单药完全抑制细胞增殖，仅能通过提高给药浓度，这必须考虑脱靶毒性。这种依赖于F2相才能实现完全抑制的效应在临床上不可避免会转变为剂量依赖性毒性。药物联合使两种或多种药物的F1相组合即能显著抑制细胞增殖，减少（若不能完全消除）剂量依赖性毒性。因此，使用双相动力学公式区分靶点特异性抑制和脱靶毒性有助于快速发现有前途的药物组合。

若细胞多驱动增殖机制正确，选择F1相靶点不重合的抑制剂进行组合，能够产生强协同抑制作用。本研究的双相分析和蛋白质印迹结果表明，dasatinib以（3.9 ± 1.9）nmol ／ L 的 Kd1抑制 Src 和 40%的SNU-387 细胞活力，BMS-754807 抑制 Akt 途径和37%的SNU-387 细胞增殖，Kd1为（5.1 ± 1.7）nmol／L，HG6-64-1 以（252 ± 82）nmol／ L 的 Kd1阻断了 MAPK途径和57%的SNU-387 细胞活力。由于这3 种药物F1相靶点不重合，阻断独立的信号通路，3 药联合使用，浓度均高于 0.3 μmol ／ L 时，SNU-387 细胞几乎被完全抑制，IC50和 IC70分别为（15 ± 1）和（42 ±3）nmol ／ L，均显著低于每种药物单独使用或两药组合的相关数值。另外，dasatinib 能够完全抑制Y416 位点Src 磷酸化，也能够通过抑制Csk 抑制Y527 位点 Src 磷酸化［24-25］，这与报道 Src 和 Csk 均对 dasatinib 很敏感的结果一致［26］。

综上所述，BMS-754807，HG6-64-1 和 dasatinib在SNU-387 细胞中的靶点并不重合，SNU-387 细胞是多驱动增殖，3 种药物联合使用能够抑制肝癌细胞增殖，可能是一种治疗肝癌的潜在药物组合。今后将使用体内实验对该药物组合的有效性进行进一步验证。