叶面喷施水杨酸对马铃薯绿原酸含量及关键酶基因表达的影响

杨慧芹 余万都 张丽颖 高冬丽 尚 轶 马 玲

（云南师范大学云南省马铃薯生物学重点实验室，马铃薯科学研究院，云南 昆明 650500）

马铃薯（Solanum tuberosum），为茄科茄属1年生草本植物，又称土豆、地蛋、洋芋等[1]。马铃薯种植可追溯到公元前8 000～5 000年的秘鲁南部。其形态特征为草本，茎分地上茎和地下茎两部分，可食用部分为地下茎。地下茎呈块状，扁球形或长圆形，直径3～10 cm，外皮呈白色、浅红色或紫色。马铃薯是全球第四大粮食作物，仅次于玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）和小麦（Triticum aestivum），已成为世界性重要的口粮来源和多种工业加工原料[2]。马铃薯在云南省的种植更为普遍，现已成为云南省第三大农作物，并成为促进云南贫困地区经济发展的主要产业。马铃薯因其含较多的淀粉、蛋白质、无机盐等，深受广大人民群众的喜爱[3]。除了食用价值之外，马铃薯还具有调中、健脾益气、消炎解毒等广泛的药用价值，所含酚酸、黄酮等酚类物质具有多种保健作用[4]。

酚类化合物是植物中分布最广泛的次生代谢产物，在植物生长发育和逆境信号转导中起着重要作用。马铃薯中最主要的酚类物质是绿原酸（CGA），它是一种天然的抗氧化剂，其抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯酸、阿魏酸、丁香酸、J基羟基茵香醚和生育酚[5]，在某些食品中可取代或部分取代目前常用的人工合成抗氧化剂。绿原酸，化学名称为3-O-咖啡酰奎尼酸，分子式为C6H18O9。绿原酸具有广泛的生物活性，研究表明绿原酸对急性咽喉炎症和化脓性皮肤疾病疗效显著，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种药用功能，现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、医药、保健和日用化工等领域[6]。此外，绿原酸等酚类物质在植物抗病中也具有重要作用[7]。在体外实验中，绿原酸具有广泛的抗真菌活性，能完全抑制孢子萌发或菌丝长度从而起到杀菌剂的作用。有研究表明，绿原酸能有效抑制马铃薯疮痂病、黑胫病和晚疫病等病原菌的侵染[8]。通过HQT合成绿原酸的途径是其主要的合成途径[9-10]，目前对这一途径中HQT基因功能的研究较为深入，越来越多的实验证明了它与绿原酸合成的直接关系。大量研究结果表明，在富含绿原酸的植物，如番茄（Lycopersicon esculentum）、烟草（Nicotiana tabacum）、朝鲜蓟（Cynara scolymus）、咖啡（Coffea arabica）和金银花（Lonicera japonica）中都存在HQT基因，并且HQT在体内体外都可以直接催化咖啡酰辅酶A与奎宁酸生成绿原酸[6]。研究表明，过表达HQT基因能明显提高植物体内的绿原酸含量[11-12]；相反，沉默HQT基因后绿原酸含量显著下降[13]。

水杨酸（SA）作为一种信号分子，在植物的抗病过程中发挥着重要作用，它能诱导植物系统获得性抗性，激活植物抗性反应，诱导某些抗性基因及抗性相关蛋白的表达，从而诱导植物对细菌、真菌和病毒等产生系统抗性[14]。鉴于绿原酸在植物抗病性方面具有重要作用，本研究以水杨酸作为诱导剂，对二倍体马铃薯叶片进行叶面喷施，研究了水杨酸对马铃薯绿原酸含量及关键酶基因HQT表达的影响，为绿原酸在植物抗病方面的研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选用的材料为国际马铃薯中心（CIP）提供的二倍体马铃薯CIP-65。取苗龄为3周的CIP-65无菌苗，选择状态良好，长势一致的移栽到直径25 cm的花盆中，置于温室内正常生长。

1.2 试验方法

1.2.1 SA叶面喷施处理

马铃薯苗移栽30 d后，分别用0.01、0.1、1 mmol/L的SA进行叶面喷施，在处理后不同时间段（6、12、24 h）分别进行叶片样品采集（选取植株顶端完全展开、状态良好、无任何病变的功能叶），液氮速冻后，-80 ℃保存备用。以0 h未经任何处理的叶片样品作为对照。

1.2.2 绿原酸含量测定

参照钟方晓[15]的方法稍作修改：准确称取0.2 g马铃薯叶片样品，加入2 mL 75%乙醇研磨匀浆，超声波在4 ℃条件下震荡萃取30 min，萃取结束后，4 ℃，12 000 r/min离心2 min，取上清适当稀释后于327 nm波长下检测吸光度，以75%乙醇为空白对照。根据标准曲线计算绿原酸含量。

标准曲线制作：以75%乙醇为溶剂，先配制成100 mL含绿原酸20 mg的溶液，再依次配制成100 mL中含绿原酸0.5、1.0、1.5、2.0 mg 4种不同浓度的绿原酸准溶液。取2 mL绿原酸标准溶液于327 nm处测出各标准溶液的吸光值，以2 mL 75%乙醇代替绿原酸标准溶液作为空白。以系列标准绿原酸浓度为横坐标，对应的吸光值为纵坐标。

1.2.3RNA提取和qRT-PCR

用天根公司的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒来提取马铃薯叶片样品中的总RNA。提取的RNA用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计进行检测，A260/A280值在1.8～2.1之间。按照TaKaRa公司的反转录试剂盒（Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser）进行反转录反应，并将反转录得到的cDNA作为荧光定量PCR反应的模板。荧光定量PCR反应根据TaKaRa公司的荧光定量分析试剂盒TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）来进行。采用StepOnePlus实时荧光定量PCR仪对马铃薯CGA合成关键酶基因StHQT进行表达检测，以马铃薯的Actin基因作为内参基因[16]，用Vector NTI软件来设计引物，序列如表1。采用2-ΔΔCT法对目的基因进行相对定量差异表达分析。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

1.3 数据分析

试验数据统计分析采用SPSS 11.5软件，采用Sigmaplot 12.5软件进行绘图，图表中的小写字母表示邓肯氏新复极差测验在P=0.05水平上呈显著性差异。

2 结果与分析

2.1 水杨酸对马铃薯叶片绿原酸含量的影响

经叶面喷施水杨酸处理后，马铃薯叶片内绿原酸含量变化如图1所示。从图中可以看出，0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA处理都能明显提高马铃薯叶片内的绿原酸含量，而1 mmol/L SA处理的效果不太明显。处理后6 h时，0.01 mmol/L SA处理的马铃薯叶片中绿原酸含量剧增，显著高于其他组中绿原酸含量的水平（P＜0.05）；0.1 mmol/L SA处理的绿原酸含量也明显增加（P＜0.05），但低于0.01 mmol/L SA处理的；而1 mmol/L SA处理的绿原酸含量有所下降。处理后12 h时，0.01 mmol/L SA处理的绿原酸含量继续增加至最高，显著高于其他2组处理的水平（P＜0.05）；0.1 mmol/L SA处理的绿原酸含量恢复到初始水平；1 mmol/L SA处理的绿原酸含量有所提高，但差异不显著。处理后24 h时，0.01 mmol/L SA处理的绿原酸含量恢复到初始水平，0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA处理的绿原酸含量也有轻微下降；此时0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA处理的绿原酸含量差异不明显，1 mmol/L SA处理绿原酸含量显著低于0.1 mmol/L SA处理的（P＜0.05），但与0.01 mmol/L SA处理的差异不显著。

图1 叶面喷施水杨酸对马铃薯叶片绿原酸含量的影响Fig. 1 Effect of foliar application of SA on the content of CGA in S. tuberosum leaves

2.2 水杨酸对马铃薯叶片HQT基因表达的影响

经叶面喷施水杨酸处理后，马铃薯叶片内绿原酸合成关键酶基因HQT的表达变化见图2。处理后6 h时，0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA处理的HQT基因表达量均有一定程度的增高，但差异不显著；1 mmol/L SA处理的HQT基因表达量无明显变化。处理后12 h时，3个浓度SA处理的HQT基因表达量都明显增高，且0.01 mmol/L SA和0.1 mmol/L SA处理的HQT基因表达量显著高于1 mmol/L SA处理的（P＜0.05）。到处理后24 h时，3个浓度SA处理的HQT基因表达量都明显降低，但0.01 mmol/L SA处理的HQT基因表达水平仍显著高于其他2个浓度处理的（P＜0.05）。

图2 叶面喷施水杨酸对马铃薯叶片HQT基因表达的影响Fig. 2 Effects of foliar application of SA on gene expression of HQT in S. tuberosum leaves

3 结论与讨论

SA是植物体内普遍存在的内源信号分子之一，在植物的生长、发育、成熟、衰老等生理过程以及抗盐、抗旱、抗低温、抗紫外线、抗重金属等抗逆反应的诱导中发挥着重要作用。SA能够有效促进植物细胞分裂和伸长，诱导一系列与抗逆有关的基因表达，提高植株体内保护酶活性，提高抗逆性，以缓解逆境胁迫下对植物造成的危害。此外，SA还能诱导植物对病毒、真菌及细菌等病原生物产生广谱而持久的抗性[17]。

叶面喷施是促进植物生长和次生代谢物积累的有效手段。在外源性水杨酸应用中，不同浓度对作物的影响效果不同，高浓度水杨酸会抑制植物的生长，只有在适宜的浓度下水杨酸才会对植物产生有利的影响。研究表明，15 mg/L的SA处理对菊花（Dendranthema morifolium）中总糖、总蛋白、总氨基酸、VC含量以及SOD活性都有不同程度的提高[18]。2 mmol / L的SA喷施丹参幼苗后，能有效调控蔗糖合成酶的活性，降低根中蔗糖合成酶的降解活性，从而增加蔗糖在丹参（Salvia miltiorrhiza）幼苗中的积累，并产生一定的影响[19]。0.1 mmol/L的外源SA能有效促进低温胁迫下黄瓜（Cucumis sativus）植株光合速率的增加，维持植株体内细胞膜的稳定性，从而使黄瓜植株在低温胁迫下良好的生长[20]。苗志奇等[21]的研究表明，0.1 mg/L的SA可以提高红豆杉（Taxus wallichianavar.chinensis）细胞培养体系中紫杉醇生物合成途径的代谢通量，使紫杉醇含量是对照组的4倍；当SA的浓度超过0.1 mg/L，紫杉醇和其他紫衫烷类物质都出现下降。李铂等[22]研究发现，叶面喷施0.5 mmol/L的SA能够促进当归（Angelica sinensis）幼苗生长，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等抗保护酶的活性，超过此浓度，植株生长受到抑制。王宏虬等[23]研究发现，SA在浓度为1.00 mmol/L时能显著提高马铃薯叶片中色素、可溶性蛋白及相关酶系（POD、CAT、PPO、PAL）含量，降低叶片中SAFR和MDA含量，增强马铃薯对疮痂病的抗性。本研究中，不同浓度SA处理对马铃薯叶片中绿原酸含量及HQT基因表达的影响不同：低浓度水杨酸（0.01 mmol/L）处理后，马铃薯叶片中的CGA含量明显提高，HQT基因的表达也被激活，与绿原酸变化趋势一致，表明HQT基因与绿原酸的生物合成有直接关系；中等浓度（0.1 mmol/L）的SA处理也明显提高了马铃薯叶片中HQT的表达量和CGA含量，但CGA含量的增幅低于0.01 mmol/L的SA处理；高浓度（0.1 mmol/L）的SA处理也在一定程度上促进了HQT基因的表达，但绿原酸的含量与处理前相比差异不大，表明只有适宜浓度的SA才能够促进马铃薯叶片绿原酸的合成与积累。本研究中马铃薯叶片的最佳处理浓度为0.01 mmol/L，与其他研究所使用的浓度存在一定差异，这可能是由于不同植物对SA的响应具有一定的差异造成的。

绿原酸等酚类物质是普遍存在于植物体内的一类次生代谢产物，具有许多关键的生理功能，对植物的品质和产量起着重要的作用。随着科学研究的深入，酚类物质与植物抗病性之间的关系得到进一步证实，这个领域的研究近年来愈发引人注目。本研究以二倍体马铃薯为试验材料，采用叶面喷施的方式，探究马铃薯绿原酸及其合成关键酶基因HQT对抗病激素SA的响应情况，可为绿原酸在植物抗病方面的研究提供一定的参考。