山竹果皮对人胶质瘤细胞U251 增殖能力的影响

邓慧芝 李铭婵 陈泽珍 李少静 廖婉琴 范丽霞（通讯作者）

（佛山科学技术学院医学院，广东 佛山 528000）

胶质瘤是神经系统最常见的原发性肿瘤，具有高复发性、高致残性、高病死率的特点，严重危害人类健康。目前，脑胶质瘤的发病机制尚未完全阐明，但遗传易感、环境污染与其发病关系密切[1]。目前对胶质瘤的治疗仍以手术为主，但由于肿瘤没有明显的边界，难以做到全部切除。胶质瘤临床治疗预后差，手术疗效有限，因而寻找新的治疗方法尤为重要。在天然药物中寻找具有调控细胞增殖、凋亡的化合物，是目前国内外抗肿瘤药物研发的热点。

山竹(Garcinia mangostana.L.)，为藤黄科藤黄属植物，为热带果品中的珍品，有“水果王后”的美誉，营养丰富,具有降燥清热解毒的功效[2]。原产东南亚,我国广东、广西、海南、台湾等省地多产。山竹适宜种植在低海拔热带地区，结果期通常需要七、八年。相较于其他水果，山竹含有丰富的蛋白质、矿物质、维生素及脂类等，外果皮中含有丰富的果胶、植物多酚类物质，可入药，具有抗氧化活性、抗菌和抗癌[3]等功效。山竹果皮中含有多种化合物，其药理作用成为了近年来的研究热点。有研究表明山竹果皮提取物对肝癌细胞HepG2 细胞[4]、人鼻咽癌CNE2细胞[5]、直肠癌细胞SW480[6]等有抑制增殖与促进凋亡的作用。

近年来有关山竹果皮提取物对胶质瘤U251 细胞的研究较少，未见有山竹果皮提取物对U251 细胞体外抗肿瘤活性的研究。本实验对山竹果皮总萃取物的抗肿瘤活性进行了研究，观察山竹果皮提取物对胶质瘤细胞U251 增殖能力的影响。

一、材料与方法

（一）材料与仪器

人神经胶质瘤细胞U251（武汉普诺赛生命科技有限公司）；DMEM培养基（Gibco公司）；胎牛血清(FBS，BI公司)；细胞计数试剂盒CCK-8（同仁化学研究所）；双抗P/S（Gibco 公司）；胰酶（Gibco公司）。

Thermo3111/8038二氧化碳培养箱（Thermo Fisher Scientific公司）；IC 1000细胞计数仪（上海睿钰生物科技有限公司）；MK3&4MK2酶标仪（Bio Tek公司）；万分之一分析天平（JJ224BC，常熟市双杰测试仪器厂）；数显恒温水浴锅（HH-4，上海亚荣生化仪器厂产）；酶标仪（美国Bio Tek 公司）。

（二）方法

1.细胞培养。

人神经胶质瘤细胞U251 细胞系培养于含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2 培养箱中培养。细胞呈贴壁生长，培养2～3 d后，用胰酶消化，用细胞计数仪显示每毫升的细胞个数及细胞活性，待细胞数达到大于（5.0～7.0）×106个/mL、活性高于90%时，取细胞用于实验。

2.溶液配制。

以10%FBS 的培养基为空白对照组，用培养基对将山竹总提取物进行稀释，得到6个浓度为0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L的溶液。

3.CCK-8 试剂检测细胞增殖状况。

将人神经胶质瘤细胞（U251）接种于96 孔板，每孔接种4000 个细胞，在37℃、5%CO2 的培养箱中孵育。当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时，以含10%FBS的培养基为空白对照组，以DMSO 处理过的细胞为阴性对照组，加入6 个质量浓度（0、2、4、8、16、32μg/mL）的山竹不同极性部位。继续37℃、5%CO2 的培养箱中培养48h 后，每孔加入10μL CCK8 溶液，37℃继续孵育1～4h 后，低速震荡30s，使用酶标仪检测细胞在450nm 处吸光度A 值，计算细胞存活率。

4.平板集落形成实验。

取对数生长期的人神经胶质瘤细胞U251，分别用胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在含10%胎牛血清的DMEM 培养液中备用。将细胞接种于6 孔板中，每孔接种500 个细胞，使细胞分散均匀。将培养板置于37℃、5%CO2 的培养箱中培养2～3 周；经常观察，当培养板中出现肉眼可见的细胞集落时，终止培养，弃去上清液；用PBS 小心浸洗2 次。用4℃预冷的甲醛固定细胞作用15min；然后吸走固定液,加适量0.5%的结晶紫染色20min，然后用双蒸水洗去染色液,空气干燥后倒置6 孔板并拍照记录。实验重复3 次。

5.数据处理。

所有实验均平行操作3 次，试验结果均表示为“平均值±标准偏差”。数据采用GraphPad Prism5 软件进行统计学分析，采用ANOVA 进行显著性分析。

二、结果与分析

（一）山竹果皮总提取物对U251 细胞的CCK-8 结果

使用CCK-8 法检测不同浓度山竹果皮提取物对U251 细胞作用48h 和72h 后的生长抑制率，图1 结果显示，48h 后随着药物浓度增大，山竹果皮总提取物对细胞增殖抑制作用呈现升高趋势；药物作用72h 后的抑制作用有所提高。本实验山竹果皮总提取物48h IC50值为9.49μg/mL，72h IC50值为7.98μg/mL。

（二）山竹果皮总取物对U251 细胞集落形成实验结果

通过细胞集落形成实验进一步观察山竹果皮总提取物对细胞增殖抑制效果，如图2 结果显示，随着药物浓度提高，细胞集落克隆形成数减少，药物抑制效果越明显。

三、结语

本研究采用了CCK-8 实验与细胞集落形成实验测定了山竹果皮总提取物对人神经胶质瘤细胞U251 增殖能力的影响。此次体外抗肿瘤活性试验结果表明山竹过果皮总提取物在对人神经胶质瘤细胞U251 增殖有抑制作用，随着药物浓度的升高，细胞的存活率相应降低。48h IC50 为9.49μg/mL，72hIC50 为7.98μg/mL，72h IC50 值比48h IC50 值有所降低，说明山竹果皮提取物具有一定的时效性。此次细胞集落形成实验进一步表明了山竹果皮总提取物对U251 细胞的增殖有抑制作用。山竹果皮总提取物在抗肿瘤方面具有不错的药用价值，其作用机制有待进一步研究，本研究结果对抗U251 肿瘤细胞新药的研发提供了一定帮助。