不同浓度桦木酸对人胃癌MGC-803细胞凋亡的影响*

樊 华， 邵淑丽,2Δ， 何孟奇， 黄 鑫,2， 张伟伟,2， 张珍珠,2

(1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院, 黑龙江 齐齐哈尔 161006; 2. 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室, 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

胃癌是由上皮组织癌变产生的恶性肿瘤，每年有近一百万新增的胃癌病例，使其成为全球癌症致死第三大主要原因[1]。目前，一般采用放疗、化疗和手术治疗胃癌，但大多数国家中其5年的生存率仍低于30%[2]。天然产物由于毒副作用小已广泛应用于临床中。一些天然药物成分可通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，据报道，紫花牡荆素通过内质网应激途径上调CHOP,eIF2α和GRP78/BiP基因表达，诱导胃癌BGC-823细胞凋亡[3]；类黄酮槲皮素通过下调P53基因表达，抑制酪氨酸激酶，抑制热休克蛋白和诱导II型雌激素受体表达从而诱导癌症干细胞凋亡，可以作为靶向癌细胞的潜在药物[4]。因此，开发新型有效的天然抗癌药物具有良好的应用前景。

桦木酸(Betulinic acid, BA)是一种萃取自白桦树的天然的多功能小分子，以游离糖苷和糖基衍生物形式存在于不同的植物器官中，具有抗病毒[5]、抗糖尿病[6]、抗高血脂[7]、抗炎[8]和抗肿瘤活性[9]。在抗肿瘤方面，桦木酸可通过线粒体途径触发肾癌细胞凋亡，并显著抑制人肾癌细胞的转移[10]，还可以通过调节人宫颈癌细胞中的PI3K / Akt信号传导和线粒体途径来诱导细胞凋亡[11]。然而，桦木酸在对抗胃癌细胞凋亡方面的研究尚未见报道。本研究通过不同浓度桦木酸作用于人胃癌MGC-803细胞系，检测桦木酸对细胞形态、Caspase-3和Caspase-9活性检测、细胞线粒体膜电位以及凋亡相关基因mRNA及蛋白表达的影响，探究桦木酸对胃癌细胞的凋亡作用，为桦木酸的开发和利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料、试剂及使用仪器

人胃癌MGC-803细胞系购自中国医学科学院肿瘤研究所。桦木酸购自北京汉博生物有限公司；胎牛血清购自以色列BI公司；Caspase-3和Caspase-9活性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；总RNA 提取试剂盒购自赛默飞世尔科技有限公司；Western及IP细胞裂解液、PI染液均购自上海碧云天生物技术有限公司；Caspase-3、Caspase-9、Cyt c和β-actin一抗购自Cell Signaling Technology；二抗购自美国LI-COR有限公司；TCSSP8激光共聚焦显微镜购自德国Leica公司；Cytomics FC500-MCL流式细胞仪购自美国Beckman coulter公司；Pealplex4四通道实时荧光定量PCR仪购自美国Eppendorf 公司；Spark 10M多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司; DYCZ-24D双垂直电泳槽、DYY-6C电泳仪均购自美国Bio-rad公司；Odyssey IR双红外荧光成像仪购自美国LI-COR公司；

1.2 细胞培养及药物处理

人胃癌MGC-803细胞系采用10%胎牛血清RPMI 1640培养基培养，培养基中需添加1×105U/L青霉素和100 μg/ml链霉素。细胞培养箱环境为37℃、5%CO2饱和湿度。将细胞密度为1.2×106的人胃癌MGC-803细胞系接种至6孔板并培养至细胞密度为70%时，分别使用加入终浓度为0、10、20、30 μg/ml的桦木酸培养基培养细胞48 h后，收集样品用于后续实验。

1.3 激光共聚焦显微镜观察细胞形态

将处理好的细胞800 r/min离心10 min并收集细胞，用提前预冷的PBS洗3次，0.5 mg/ml吖啶橙37℃孵育10 min后，利用激光共聚焦显微镜观察细胞形态。

1.4 Caspase-3和Caspase-9活性检测

将收集好的细胞加入裂解液冰浴裂解，离心后取上清配制标准品稀释液，取60 μl反应缓冲液、35 μl待测样品和5 μl DEVD-pNA底物混合均匀，37℃避光孵育2 h，使用酶标仪检测A405指标并记录结果。

1.5 流式细胞术检测线粒体膜电位

将IPLJC-1加入到500 μl预热好的1×Incubation Buffer配成JC-1工作液，用预冷的PBS洗涤细胞2次，2 000 r/min离心3 min，并用制好的JC-1工作液悬浮细胞，制成1×106cells/ml细胞悬液并置于37℃，5% CO2细胞培养箱中孵育30 min。孵育完成后，2 000 r/min离心10 min，再洗涤细胞2次，用500 μl 1×Incubation Buffer重悬细胞，并使用400目筛网过滤，通过流式细胞仪检测。

1.6 qRT-PCR检测凋亡相关基因mRNA的表达

将桦木酸处理好的细胞提取总RNA并反转录成cDNA。以cDNA为模板，凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9和Cytc基因的引物(表1)，β-actin为内参，进行qRT-PCR检测。每组实验重复3次，扩增结束后以2-ΔΔCt方法计算目的基因mRNA相对表达量。

Tab. 1 Primers for qRT-PCR analysis

1.7 Western blot检测凋亡相关基因蛋白的表达

将蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳后进行转膜，转膜结束用立春红染色。封闭1 h后进行一抗，4℃摇床过夜。PBST洗涤3次，每次15 min，再避光进行二抗孵育2 h，PBST再洗涤3次，每次15 min，使用Odyssey IR成像仪避光扫描蛋白条带，并使用ImageJ软件检测各条带的灰度值，将目的蛋白条带灰度值和内参蛋白条带灰度值之比表示蛋白相对蛋白表达水平。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 桦木酸对MGC-803细胞形态的影响

正常人胃癌MGC-803细胞经过吖啶橙染色后在激光共聚焦显微镜下观察细胞形态如图1A所示：所呈现均匀一致的绿色荧光，经染色的核呈圆形，包膜完整。当用不同浓度桦木酸处理人胃癌MGC-803细胞48 h后，细胞形态如图1B、1C、1D所示：部分染色体出现浓缩现象，高度聚集，部分细胞核裂解成碎片。

Fig. 1 Cell morphology of MGC-803 cells treated with betulinic acid for 48 h under a laser confocal microscope (acridine orange ×200， bar=10 μm)

2.2 桦木酸对MGC-803细胞Caspase-3和Caspase-9活性影响

桦木酸对人胃癌MGC-803细胞Caspase-3和Caspase-9活性检测如表1所示：经过不同浓度的桦木酸作用细胞48 h后，Caspase-3和Caspase-9相对活性随着药物浓度增大而升高，并在20 μg/ml桦木酸时活性最高，与对照组相比具有统计学意义(P<0.01)。

2.3 桦木酸对MGC-803细胞线粒体膜电位影响

分别加入浓度为0、10、20、30 μg/ml桦木酸作用人胃癌MGC-803细胞48 h后，用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位变化，结果如图2所示：对照组细胞线粒体膜电位为99.0±1.2，终浓度为10、20、30 μg/ml桦木酸处理后细胞线粒体膜电位分别为： 81.7±1.47、37.5±1.35和71.5±0.96。与对照组相比，各处理组线粒体膜电位均降低，且当桦木酸浓度为20 μg/ml时，线粒体膜电位最低(P<0.05，P< 0.01,表2)。

Tab. 1 The effects of betulinic acid on Caspase-3 and Caspase-8 activities in MGC-803 cells n=3)

2.4 桦木酸对MGC-803细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响

qRT-PCR检测不同浓度桦木酸作用人胃癌MGC-803细胞48 h凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9和CytcmRNA的表达。经过处理的细胞Caspase-3、Caspase-9和CytcmRNA的表达显著增加且桦木酸浓度为20 μg/ml时表达量最高(P<0.01，表2)。

Tab. 2 Mitochondrial membrane potential and the expressions of Cyt c，Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in MGC-803 cells n=3)

2.5 桦木酸对MGC-803细胞凋亡相关基因蛋白表达的影响

Western blot检测不同浓度桦木酸作用人胃癌MGC-803细胞48 h后对Caspase-3、Caspase-9和Cyt c蛋白表达影响。如图3所示：经过处理的细胞Caspase-3、Caspase-9和Cyt c的蛋白表达显著增加且桦木酸浓度为20 μg/ml时表达量最高(P<0.01，表3)。

Tab. 3 The effects of betulinic acid on protein levels of Caspase-3, Caspase-9 and Cyt c n=3)

Fig. 3 The effects of betulinic acid on protein levels of Caspase-3, Caspase-9 and Cyt c (n=3)

3 讨论

胃癌是全球死亡率较高的癌症之一，尽管外科手术和辅助疗法有所改善，但胃癌患者的5年总生存率仍然很低。预后不良与胃癌高转移和复发率密切相关。此外，由于耐药性等多种因素的影响，化疗和放疗的疗效有限[12]。近年来天然产物对癌症的治疗已成为人们的研究热点，据报道冬虫夏草的乙醇提取物可以抑制胃癌SGC-7901细胞增殖，诱导细胞凋亡并将细胞周期阻滞在S期[13]；传统中草药显齿蛇葡萄(又名藤茶)的主要活性成分二氢杨梅素通过 JNK 通路下调MMP-2 蛋白表达水平、逆转上皮间质转化，具有抑制人胃癌 MKN-45 细胞迁移及侵袭的作用[14]；白花蛇舌草(注射液)能够使人胃癌MKN-45线粒体膜电位降低，上调Cyt c、Caspase-3和Caspase-9基因表达，诱导细胞凋亡进而发挥抗胃癌的作用[15]。桦木酸是一种天然存在的五环戊烷型三萜化合物，可以抑制胰腺癌细胞增殖，将细胞周期阻滞于G0/G1期[16]且通过抑制STAT3的活化提高胰腺癌细胞对吉非替尼的敏感性，抑制胰腺癌细胞增殖和促进细胞凋亡[17]。本实验以桦木酸为材料，探究桦木酸对胃癌细胞MGC-803的作用及作用机制。

细胞凋亡是细胞死亡的高度调控的过程，为了牺牲特定细胞以获得更大机体益处而做出的合理而积极的决定。在生物医学领域中，很多利用小分子药物刺激诱导癌细胞凋亡治疗癌症的方法十分有效[18]。Caspase-3、Caspase-9和Cytc基因是与细胞凋亡密切相关的三个基因，Caspase-3和Caspase-9是胱天蛋白酶家族成员，凋亡途径起始于被激活的胱天蛋白酶，而Caspase-3的激活意味着细胞凋亡是不可逆的[19]。细胞色素c(cytochrome c，Cyt c)是属于c型细胞色素家族I类的蛋白质，与细胞凋亡密切相关，当Cyt c被释放到细胞质中与APAF-1结合，激活Caspase-9，并触发导致细胞死亡的酶联级联反应[20]。本实验结果证明了在终浓度为10 ～30 μg/ml浓度范围内的桦木酸作用人胃癌MGC-803细胞48 h后出现凋亡特征，Caspase-3和Caspase-9活性随桦木酸浓度增加显著升高，且在桦木酸浓度为20 μg/ml时，Caspase-3和Caspase-9活性最高，线粒体膜电位显著降低并且凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9和CytcmRNA和蛋白表达升高，且当桦木酸浓度为20 μg/ml时表达量最高。

综上所述，在终浓度为10 ～30 μg/ml浓度范围内，桦木酸通过上调凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9和Cytc的表达诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡，且当浓度为20 μg/ml时桦木酸的促凋亡作用最佳。