原子力显微镜成像技巧的探讨

郑美青 薛 冰

(首都医科大学 中心实验室，北京 100069)

原子力显微镜(Atomic Force Microscopy, AFM)原理是在反馈控制系统的作用下，根据针尖曲率半径在纳米尺度的微小探针与样品间的相互作用，去感触样品表面形貌的变化，就如同人在大脑地控制下，用手去感触物体表面形貌。就原子力显微镜而言，其反馈到中央控制系统的参数是探针与样品间的相互作用力，因此，可以更容易地获得样品的力学参数。

原子力显微镜样品制备相对简单，对样品损伤小，无需进行染色、包埋等复杂处理过程，对测试环境要求不高，在空气和液态环境下都可以进行测试，可用于表征普通材料样品和生物样品[1，2]，例如 DNA、蛋白质和活性细胞[3-6]。相对于光学显微镜，原子力显微镜可以有更好的分辨率。

实际扫描的过程中，原子力显微镜的成像图是原子力探针和样品共同卷积的结果，所以探针的选择、样品的制备直接决定成像质量。

1 探针对原子力显微镜的成像的影响

在扫描样品表面时，探针的微小针尖与样品表面相互作用，使探针的微悬臂发生形变。由激光二极管发出的激光束照射在探针的微悬臂末端，当微悬臂发生形变时，激光束的反射光束也发生相应的变化，通过四象限光电探测器接收反射后的激光束，对所获得的信息进行转换、放大，输出电压检测信号。计算机通过比较检测信号和预先设置的参考信号来实时调整压电陶瓷扫描器在Z 轴方向上的伸缩量，实现反馈控制。计算机通过软件编程对检测信号进行处理，获取样品表面形貌图像以及相应的物理量[7]。

探针[8]分基底(Substrate)、悬臂(Cantilever)和针尖(Tip)三部分。悬臂相当于力传感器，根据悬臂形状，探针可分为矩形悬臂和三角形悬臂。探针质量好坏以及探针参数会直接影响最后的成像。选择探针不是由哪种扫描模式决定，实验中要根据探针的参数去选择。选择探针的基本原则是：悬臂的软硬度要适中，既保证样品要产生足够的形变量，又要保证有足够的探测灵敏度。

1.1 弹性系数(k)

不同模式[9]下，应选择不同弹性系数的针。以布鲁克原子力显微镜为例，智能成像模式基于peakforce tapping mode，探针以正弦驱动方式离开和接近表面。我们要确保探针敲到表面之后可以离开，因为样品表面有粘附力的影响，如果探针太软，样品粘附力比较大，探针形变比较大，样品会拽着探针不让离开，可能扫描器把探针拉到最高点的时候还没分开，一般选择弹性系数小于1N/m的探针就可以。

Tapping mode振幅比较小，一般在几个nm到几十个nm，克服粘附力是完全要依靠蕴藏在探针里的能量来离开样品表面。弹性系数k越小，悬臂里的能量越小，越不容易离开样品表面。Tapping振幅又小，所以要求探针的k要大，一般要选择k大于2N/m的针。

接触模式是探针直接压到样品表面来回划，力越大越容易破坏样品，所以尽量选择k小的探针来做成像，太硬的针会划伤样品表面。同时我们应参考样品的弹性模量大小来选择探针。

1.2 曲率半径(tip radius)

AFM有横向分辨率和纵向分辨率，决定它们的因素不一样。曲率半径主要影响AFM的横向分辨率，一般情况下，曲率半径越小，针尖越尖，横向分辨率越高。探针尖端尖不尖，用钝针和尖针得到的效果是完全不一样的，如图1，同一个样品，如果选择曲率半径小的尖针成像(图1 b)，针尖可以更好地插入样品，得到更高分辨率的成像。

图1 钝针(a)和尖针(b)的成像

1.3 悬臂镀层

悬臂是AFM力的传感器，所以它非常重要，控制力其实就是控制悬臂的弯曲量。探针背面的镀层会增加悬臂反射率，提高信噪比。镀层一般会选择金、铝等材质，带镀层的针sum值位于4.0～7.5V，不带镀层的针sum值位于1.5～2.5V。镀层的质量也会影响到成像质量，成像有干涉条纹出现，一般情况是由于光调偏了，会有光漏出，也有可能是镀层质量有问题。实验中激光位置应该在悬臂前半部分，找sum值最大的位置。

大部分情况下，应该选背面有镀层的针来做成像，特别是做peakforce tapping时。变温实验时要选择不带镀层的悬臂，因为悬臂和镀层材料不一样，温度变化时热膨胀系数不一样，悬臂会变弯，vertical一直在飘，所以变温实验时要避免选择带镀层的针。

1.4 Deflection sensitivity

Deflection sensitivity代表垂直形变量的灵敏度，这个值很重要，在做力学实验中首先要校准Deflection sensitivity。数越小，探测小的形变量的sensitivity越高，因此如果要测量特别小的形变量时，我们应该选择Deflection sensitivity数比较小的探针。因为Deflection sensitivity跟悬臂的长度成正比，跟光路的长度成反比，因此要选悬臂短一些的针。

1.5 假象的问题

针尖形状会影响到横向分辨率，扫描的过程中会经常遇到两种情况，一是探针被污染了，粘上东西了，相当于探针的形状有变化，还有一种情况是，在做成像的过程中，因为力的原因逐渐把探针磨钝了，相当于探针的形状有了变化，所以分辨率会有变化。这两种情况下，所测得结果卷积了探针形状的改变，成像不真实，因此实验中需要排除可能存在的这些假象，如图2。

图2 探针被污染或者变钝的成像

2 样品对原子力显微镜的成像的影响

2.1 样品制样

AFM样品制样原则，一要求基底干净，二样品要固定在基底上，如果样品固定不好，或者样品表面起伏太大，会导致力曲线很不稳定。常用的固定方法有四种：一是范德华力，可以用胶将样品粘在基底上，大多数情况下可以选双面胶，导电实验时用银胶；二是用化学键固定，比如表面修饰，经常用到的化学键是金硫键，硫醇的巯基在外面，固定到金的表面；三是酰胺键，在羟基或者氨基表面，样品用氨基或者羟基结尾，形成酰胺键；还有一种是用静电力，利用样品和基底表面的电荷，比如很多DNA是带负电荷[10]的，要把基底表面修饰成带正电荷的，通过静电作用固定样品如图3，基底修饰后的成像分辨率明显提高很多。

图3 云母基底修饰前后的成像图a.修饰前；b.修饰后

最常用的基底是云母片，云母基底非常好用，每一层都是原子级平整的，不需要额外清理、清洗，前提是要选用高质量的云母。第二种基底是石墨，也是原子级平整，这两种基底一个是亲水，一个是疏水，在原子力的实验中应用比较多，处理比较简单。

2.2 样品的安装

安装样品时不要引入太多噪声，如果样品大于样品台，安装样品时会引起样品台边缘震动，噪声会比较高，甚至会覆盖样品本身的信号。

2.3 样品带电问题

同样的样品在不同的带电条件下，测出来的结果不同。如果用tapping mode来做成像，一定要排除静电影响。原因是tapping mode是通过振幅来成像，但如果样品和探针之间有额外的静电作用力的话，会引起探针共振峰的移动，即使高度没有变化，引入额外的静电力也会导致振幅变化，tapping将所有的振幅变化都反映在高度里边，所以额外的静电力会对高度有贡献。这时虽然看到的图很漂亮，但结果是错误的。

2.4 样品污染的问题。

实验中可能会遇到这种情况，本来很细腻的颗粒，成像突然变得很大，很显然是探针被污染了，污染的东西掉下来之后又可以继续扫，如果是peakforce QNM，可以根据粘附力变化来判断样品是否被污染。

2.5 样品老化的问题。

有些样品容易老化，不能放置时间太久，一定要新制的样品才可以检测，空气中放置后就会无法检测。

3 总结

原子力显微镜是一种纳米级测量分析仪器，仪器非常灵敏，影响因素较多，大致包括探针、样品、AFM成像系统、软件设置以及人为的参数调节等几大类。本文总结了探针的弹性系数、曲率半径、悬臂镀层对成像的影响，以及制样、装样时可能存在的问题，实验中为获得更准确的成像，我们需要尽量克服样品可能存在的这些问题，并选择最优的探针来对其成像。