脂质过氧自由基诱导兔肉肌浆蛋白聚集机制

王兆明，徐宝才，李洪军

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230009；3.农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009）

兔肉营养价值高，具有“四高四低”（高蛋白、高赖氨酸、高卵磷脂、高消化率和低脂肪、低胆固醇、低尿酸、低热量）的特点。此外，兔肉还具有优良的保健性能，Zotte等[1]指出兔肉富含生物活性物质的特点对于控制心血管病及其他慢性疾病有重要的作用，可以作为功能性食品。Hermida等[2]证实兔肉“高钾低钠”的特点使其适于高血压病人食用。同时，兔肉因烟酸含量高而具有美容的功效，被称为“美容肉”[3]。

在兔肉蛋白质中，肌浆蛋白是一种重要的蛋白质组分，约占总蛋白质组成的30%～34%[4]。肌浆蛋白是复杂的混合物，含有肌红蛋白和多种代谢酶等组分。肌浆蛋白大多含有球蛋白结构并具有水溶性[5]。球蛋白能够赋予肌浆蛋白功能性质，例如，肌红蛋白溶解性功能依赖于球蛋白[6]。作为肌肉蛋白的重要组分，肌浆蛋白与肉的品质密切相关。尽管Marino等[7]指出肌浆蛋白不是肌肉的结构蛋白（肌原纤维蛋白），并且原位可溶性的特点使得肌浆蛋白组分的变化与肉的嫩度变化无关，但是肌浆蛋白对肉的保水性和色泽等品质特性具有重要的影响[8]。肌浆蛋白中的肌红蛋白直接影响鲜肉的色泽。肌浆蛋白中钙蛋白酶氧化可以影响其对蛋白质的水解活性，从而对鲜肉品质产生负面影响[9]。Liu Jiao等[10]研究发现变性的肌浆蛋白可以在肌原纤维外形成具有保水能力的蛋白质网络结构，从而增强保水性。

不饱和脂质在引发剂（光、加热、氧气、金属等）的作用下会脱氢生成自由基，这些脂质自由基会与氧气发生反应生成过氧自由基（ROO·）。ROO·作为链传递反应的载体不仅可以攻击不饱和脂质，还可以攻击蛋白质中富含电子的位点，引发蛋白质的氧化反应。蛋白质氧化可以引起蛋白质物理化学性质的变化，例如构象、溶解度以及水解敏感性，从而影响肉品品质[8]。交联聚集是蛋白质氧化的重要形式，肌浆蛋白聚集对肌肉的保水性和色泽等具有重要影响[8]。利用偶氮二异丁脒盐酸盐（2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）的热分解作用生成ROO·已经在脂质氧化模拟体系中广泛应用[11-12]。AAPH在37 ℃条件下会自发分解生成一分子氮和两分子碳中心自由基，后者可以迅速与分子氧反应生成ROO·[13]。在含有蛋白质的溶液中，AAPH能够以1.36×10－6mol/（L·s）的恒定速率生成ROO·，并且生成ROO·的量与AAPH浓度成正比[13]。Zhou Feibai等[11]指出AAPH衍生的ROO·体系能够模拟ROO·的稳定形成，从而可以与肉的一些实际贮藏情况进行比较。国内外学者已经研究了ROO·对肌原纤维蛋白的氧化修饰效应[11,14]，但是目前鲜见关于脂质氧化产物对肌浆蛋白氧化修饰的相关报道。Hęś等[15]指出脂质氧化产物中的过氧化物与蛋白质之间具有较高的反应活性，两者在有水的基质中则反应更剧烈。因此，相较于肌原纤维蛋白，肌浆蛋白（水溶性蛋白）可能是ROO·（具有水溶性）优先攻击的蛋白质组分。明确ROO·诱导肌浆蛋白氧化聚集的机制有助于全面理解兔肉品质的形成。基于此，本实验利用AAPH的热分解稳定地生成ROO·，研究其对兔肉肌浆蛋白聚集行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

伊拉配套系商品代公兔（体质量2 200～2 500 g）购自阿兴记原种兔养殖基地。按常规方法击晕宰杀、去皮、去头、去内脏后迅速分割取后腿，用取样箱（箱内温度约为6 ℃）在5 h内迅速运回实验室后置于－80 ℃的冰箱中备用。所有样品均在30 d内使用。

所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA323S电子分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；S25涡旋混合器 德国IKA集团；5810型台式高速离心机 德国Eppendorf公司；UV-16001紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器有限公司；Avanti J-30I冷冻离心机 美国贝克曼库尔特公司；DW-86W100超低温冰箱 青岛海尔集团；HH-6数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；XHF-D内切式匀浆机 宁波新芝生物科技股份有限公司；Elix10纯水机美国密理博公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell电泳系统美国Bio-Rad公司；ZEN3690激光粒度分析仪 英国马尔文仪器公司；SCIENTZ-10N普通型冷冻干燥机 宁波新芝冻干设备股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌浆蛋白提取

参照Chen Qian等[16]的方法适当修改后提取兔肉肌浆蛋白。取25 g绞碎的兔肉样品于250 mL的离心管中，加入100 mL冰浴磷酸盐缓冲液（40 mmol/L、pH 6.8），10 000 r/min均质处理30 s。均质液在5 000×g条件下冷冻离心30 min。离心后用定性滤纸过滤上清液，过滤液即为肌浆蛋白。以上操作均在冰浴条件下进行。用双缩脲法测定蛋白质量浓度。

1.3.2 肌浆蛋白氧化体系的制备

将1.3.1节提取的肌浆蛋白溶液用磷酸盐缓冲液（40 mmol/L、pH 6.8）调节质量浓度至10 mg/mL。分别取上述溶液50 mL于6 个磨口玻璃瓶中。然后加入AAPH溶液，使得肌浆蛋白溶液中AAPH的最终浓度分别为0、1、2、3、4 mmol/L和5 mmol/L。将得到的混合溶液在37 ℃条件下避光摇动5 h。随后将样品溶液在冰浴条件下冷却至4 ℃，并在10 000×g条件下冷冻离心15 min。将上清液在4 ℃的高纯水中透析（透析袋截留分子质量7 kDa）60 h以除去残留的AAPH，每10 h更换一次高纯水。最后冷冻干燥得到氧化的肌浆蛋白样品。

1.3.3 高铁肌红蛋白相对含量的测定

将肌浆蛋白溶液用高纯水稀释至质量浓度为5 mg/mL。分别在503、525、582 nm和557 nm波长处测定吸光度。参考Wang Zhaoming等[17]的方法按式（1）计算高铁肌红蛋白（methemoglobin，MetMb）的相对含量。

1.3.4 超铁肌红蛋白浓度的测定

参考Wang Zhaoming等[17]的方法测定超铁肌红蛋白Mb(IV)＝O浓度。将1.3.3节制备的肌浆蛋白溶液在412 nm波长处测定吸光度，根据摩尔消光系数（111 mmol/（L·cm））计算Mb(IV)＝O浓度。

1.3.5 肌浆蛋白羰基含量的测定

参考Zhou Feibai等[11]的方法适当修改后测定肌浆蛋白羰基含量。将1.3.2节不同浓度AAPH处理的肌浆蛋白样品分别用磷酸盐缓冲液（20 mmol/L、pH 6.0）调整到质量浓度为5 mg/mL，从每一组样品中分别取两份蛋白质溶液（0.4 mL）于2 mL的离心管中。其中一份用800 μL的2 mol/L HCl溶液（含有0.2 g/100 mL的2,4-二硝基苯肼）处理，记为处理组；另一份用800 μL的2 mol/L HCl处理，记为空白组。将处理组和空白组样品在室温下反应30 min后，加入400 μL的三氯乙酸（40 g/L）沉淀蛋白质。随后离心处理（4 ℃、5 000×g、5 min），并移除上清液。加入1 mL乙醇-乙酸乙酯混合液（1∶1，V/V）洗涤沉淀以除去未反应的2,4-二硝基苯肼，随后进行离心（4 ℃、5 000×g、5 min）。上述洗涤过程重复3 次后，加入1.5 mL的磷酸盐缓冲液（20 mmol/L、pH 6.5，含有6 mol/L盐酸胍）溶解沉淀。放置过夜后，在370 nm波长处测定吸光度，蛋白质羰基含量根据摩尔消光系数（22 000 mmol/（L·cm））计算。

1.3.6 肌浆蛋白总巯基含量的测定

参考Kang Dacheng等[18]的方法适当修改后测定蛋白总巯基含量。用磷酸盐缓冲液（20 mmol/L、pH 6.0）将1.3.2节肌浆蛋白质量浓度调整到5 mg/mL。吸取1 mL肌浆蛋白溶液，用9 mL的磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 7.0，包含8 mol/L尿素、0.6 mol/L NaCl、10 mmol/L EDTA-2Na）稀释。取3 mL的稀释液于试管中，加入0.4 mL 0.1%的5,5’-二硝基(2-硝基苯甲酸)，随后在40 ℃下避光放置25 min。冷却至室温后在412 nm波长处测定吸光度。总巯基含量根据摩尔消光系数（13 600 mmol/（L·cm））计算。

1.3.7 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

用磷酸盐缓冲液（40 mmol/L、pH 6.8）将1.3.2节肌浆蛋白质量浓度调整为1 mg/mL。取1 mL的蛋白质溶液分别加入4 mL含有质量分数1%β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）（还原条件）和不含有β-ME（非还原条件）的上样缓冲液中，在沸水条件下加热3 min。冷却至室温后离心（3 000×g、5 min），取10 μL上清液上样。在30 mA的条件下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。电泳结束后，在1 L染色液中（内含100 mL冰醋酸、100 mL甲醇和1 g考马斯亮蓝R-250）染色处理1 h，随后在1 L脱色液（内含100 mL冰醋酸和100 mL甲醇）中脱色处理5 h。

1.3.8 肌浆蛋白内源荧光强度的测定

参考Jiang Wenxin等[19]的方法并适当修改测定蛋白内源荧光光谱。用磷酸盐缓冲液（20 mmol/L、pH 6.0）将1.3.2节冻干肌浆蛋白溶解至0.5 mg/mL，用荧光分光光度计记录300～500 nm波长处的光谱，激发波长为295 nm，扫描速率为1 500 nm/min。

1.3.9 肌浆蛋白表面疏水性的测定

参考Chelh等[20]的方法修改后测定蛋白质表面疏水性。1.3.2节冻干肌浆蛋白用磷酸盐缓冲液（20 mmol/L，pH 6.0）溶解至5 mg/mL。随后，取1 mL的蛋白溶液与0.2 mL 1 mg/mL溴酚蓝溶液混合。同时制备对照组样品，即取1 mL磷酸盐缓冲液加入0.2 mL的溴酚蓝溶液。所有样品在25 ℃下振荡10 min后离心（4 ℃、2 000×g、15 min）。取0.4 mL上清液，加入3.6 mL磷酸盐缓冲液（20 mmol/L、pH 6.0）稀释，在595 nm波长处测定光密度值。肌浆蛋白质表面疏水性以溴酚蓝结合量表示，按式（2）计算。

式中：ODcontrol为对照组在595 nm波长处光密度值；ODsample为样品在595 nm波长处光密度值。

1.3.10 肌浆蛋白粒度的测定

参考Bao Zhijie等[12]的方法适当修改后测定肌浆蛋白粒度。用高纯水将1.3.2节冻干肌浆蛋白溶解后，调整质量浓度至0.25 mg/mL。用激光粒度分析仪测定肌浆蛋白的粒度分布。仪器参数设置为物质折射率1.520、介质为水、介质折射率1.333。

1.3.11 肌浆蛋白浊度的测定

参考Chen Nannan等[21]的方法适当修改后测定肌浆蛋白浊度，将1.3.2节冻干肌浆蛋白溶于磷酸盐缓冲液（40 mmol/L、pH 6.8）中，蛋白质量浓度调节至5 mg/mL。在600 nm波长处测定分散体的吸光度，以吸光度表示样品的浊度。

1.3.12 肌浆蛋白溶解度的测定

用磷酸盐缓冲液（40 mmol/L、pH 6.8）将1.3.2节冻干肌浆蛋白溶解至5 mg/mL。在10 000×g条件下冷冻离心15 min。分别测定离心前后的蛋白质量浓度。蛋白溶解度按式（3）计算。

1.4 数据处理与分析

所有实验均重复测定3 次，所有数据均以平均值±标准差表示。运用SPSS 19.0软件对实验数据进行单因素方差分析（one-way analysis of variance，One-way ANOVA），用Tukey HSD法进行显著性分析，以P＜0.05表示差异显著。采用Origin 8.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 ROO·对MetMb相对含量和Mb(IV)＝O浓度的影响

不同浓度AAPH处理对兔肉肌浆蛋白中MetMb相对含量的影响如图1所示，随着AAPH浓度的增大，MetMb相对含量显著升高（P＜0.05），说明ROO·可以促进肌红蛋白的自动氧化。Celedón等[22]报道了AAPH产生的ROO·可以促进血红蛋白的氧化，这与本研究的结果类似。通常而言，肌红蛋白自动氧化仅仅指血红素内铁原子的氧化，而不涉及球蛋白氨基酸残基的氧化修饰。在肌红蛋白分子中，球蛋白可以保护肌红蛋白血红素辅基免受外部氧化环境干扰[6]。ROO·对球蛋白的氧化修饰可能引起其结构的变化，继而导致其对血红素辅基保护功能减弱，使得血红素内的铁原子容易接触到氧化环境，发生自动氧化反应。

图1 AAPH处理对肌浆蛋白中MetMb含量的影响Fig. 1 Changes in MetMb in sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

由图1可知，随着AAPH浓度的增大，Mb(IV)＝O浓度显著增加（P＜0.05）。在DeoMb和OxyMb自动氧化过程中，会生成超氧阴离子自由基和中性超氧阴离子自由基（O2·），二者可以相互反应（和质子）生成H2O2

[23]。在H2O2存在的情况下，MetMb可以进一步发生氧化反应生成血红素自由基阳离子，即Mb·＋(IV)＝O[17]。Mb·＋(IV)＝O可以迅速与周围的球蛋白发生电子转移，生成以Fe(IV)＝O为中心的球蛋白自由基，即Mb(IV)＝O前体物质——·Mb(IV)＝O[17]，·Mb(IV)＝O不稳定，随即转化为Mb(IV)＝O。本研究结果表明ROO·可以促进肌红蛋白的自动氧化和MetMb的生成（图1）。因此，随着AAPH浓度增大，·Mb(IV)＝O/Mb(IV)＝O前体物质含量逐渐升高，这可能是本研究中AAPH处理样品中Mb(IV)＝O浓度显著增加的主要原因。

2.2 ROO·对肌浆蛋白羰基和总巯基含量的影响

不同浓度AAPH处理的兔肉肌浆蛋白羰基含量变化如图2所示。对照组肌浆蛋白羰基含量为0.94 nmol/mg，这一结果与Lund等[24]报道的新鲜猪肉肌浆蛋白中的羰基化合物含量接近。随着AAPH浓度的增大，肌浆蛋白羰基含量显著增加（P＜0.05），并呈现出线性增长趋势。当AAPH浓度为5 mmol/L时，肌浆蛋白羰基含量达到最大值，为3.29 nmol/mg，该值与Yang Hua等[25]报道的猪肉贮藏4 d时肌浆蛋白羰基含量接近。蛋白质氧化可以通过自由基链式反应进行。ROO·是亲电性自由基，优先攻击蛋白质分子中的富电子位点[13]。ROO·可以从蛋白质分子中的C—H（或S—H）键中提取氢原子[26]，引发蛋白质的自由基链式反应。ROO·直接攻击敏感氨基酸残基是引起蛋白质羰基化的主要原因。

由图2可知，对照组肌浆蛋白总巯基含量为104.68 nmol/mg，这一结果与Li Binbin等[27]报道的四川香肠肌浆蛋白中的总巯基含量接近。肌浆蛋白中含有多种酶类物质，细胞中的酶类大多具有半胱氨酸残基[28]，而半胱氨酸是蛋白质分子中含有巯基基团的主要氨基酸。因此，巯基主要来源于肌浆蛋白中的酶类物质。随着AAPH浓度的增大，肌浆蛋白总巯基含量显著降低（P＜0.05）。总巯基含量的下降可能与二硫键的生成有关。总巯基含量越低，蛋白质氧化越严重。因此，巯基含量的变化说明随着AAPH浓度的增大，肌浆蛋白氧化程度加剧。这与肌浆蛋白羰基含量变化所反映出的结论相一致。

图2 AAPH处理对肌浆蛋白羰基含量和总巯基含量的影响Fig. 2 Changes in carbonyl and total sulphydyl contents of sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

2.3 SDS-PAGE分析结果

肌浆蛋白是肌浆中的水溶性蛋白，包含糖酵解途径的大部分酶、肌酸激酶和肌红蛋白等[29]。由图3可知，在兔肉肌浆蛋白电泳条带中主要包括糖原磷酸化酶b、丙酮酸激酶、肌酸激酶、醛缩酶、磷酸甘油醛脱氢酶和肌红蛋白等。这一结果与Wang Zhaoming等[30]报道的兔肉肌浆蛋白SDS-PAGE结果一致。

图3 AAPH处理对肌浆蛋白在非还原（A）和还原（B）条件下凝胶电泳图谱的影响Fig. 3 SDS-PAGE patterns of fresh and AAPH-treated sarcoplasmic proteins in the absence (A) and presence (B) of β-mercaptoethanol

在不含有β-ME的情况下（非还原条件），肌浆蛋白中糖原磷酸化酶b、肌酸激酶和醛缩酶等条带灰度随着AAPH浓度的增加逐渐减弱，而在浓缩胶顶部有聚集物生成，并且聚集物条带灰度随着AAPH浓度增大逐渐增强（如图3A中红框区域所示），这说明ROO·导致了肌浆蛋白交联的生成。在β-ME存在的条件下（还原条件），消失的肌浆蛋白组分复原，并且伴随着浓缩胶顶部聚集物消散（如图3B中红框区域所示），表明肌浆蛋白组分主要是通过二硫键产生蛋白质交联。ROO·可以从半胱氨酸的S—H基团中提取氢原子并产生硫中心自由基[23]，其可以进一步与其他蛋白质分子的巯基反应以形成二硫键交联。

2.4 ROO·对肌浆蛋白色氨酸荧光光谱的影响

不同浓度AAPH处理的兔肉肌浆蛋白色氨酸荧光光谱如图4所示，对照组兔肉肌浆蛋白在334 nm波长处具有最大荧光强度，这与Sun Weizheng等[31]在猪肉肌浆蛋白研究中报道的结果一致。这一结果符合色氨酸残基在相对疏水的环境中的典型内源荧光特征图谱。未氧化组肌浆蛋白最大荧光强度为4 538 A.U.，随着AAPH浓度的增大，肌浆蛋白内源荧光强度呈现出逐渐下降的趋势，在AAPH浓度为5 mmol/L时，最大荧光强度减小为3 180 A.U.。蛋白质内源荧光强度的下降可以反映蛋白质三级结构的变化。在本研究中，内源荧光强度的下降说明了ROO·可以引起肌浆蛋白的去折叠。Chanarat等[32]指出在氧化过程中，蛋白质的构象发生了变化，蛋白质分子内的疏水部分会暴露出来。Wu Wei等[33]认为蛋白质最大荧光强度的减小是由蛋白质-蛋白质相互作用导致的色氨酸残基所处微环境变化引起。此外，在蛋白质氨基酸中，色氨酸较为敏感，易于发生氧化反应，并且色氨酸氧化处在蛋白质氧化级联反应的上游。ROO·可以从色氨酸中提取氢生成蛋白质自由基[34]。色氨酸的直接氧化也会导致荧光强度的下降[35]。因此，本研究中ROO·引起荧光强度下降的原因可能包括色氨酸残基的直接氧化、色氨酸残基的暴露以及色氨酸残基微环境的变化。

图4 AAPH处理对肌浆蛋白内源荧光强度的影响Fig. 4 Changes in fluorescence spectra of sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

2.5 ROO·对肌浆蛋白表面疏水性的影响

不同浓度AAPH处理的兔肉肌浆蛋白表面疏水性如图5所示。随着AAPH浓度的增大，肌浆蛋白表面疏水性逐渐增大。通常而言，氧化可以改变蛋白质的二级和三级结构，导致蛋白质的疏水性等物理性质发生变化[36]。蛋白质发生去折叠后，内部的疏水性基团暴露，继而引起表面疏水性增大。表面疏水性可以反映蛋白质分子表面的疏水性氨基酸残基的分布情况[37]。蛋白质表面疏水性与蛋白质分子之间的疏水相互作用密切相关[9]。蛋白质表面疏水性越大，蛋白质疏水相互作用越强。综上，本研究结果表明ROO·诱导的肌浆蛋白氧化修饰可以增强蛋白质分子间的疏水相互作用。

图5 AAPH处理对肌浆蛋白表面疏水性的影响Fig. 5 Changes in surface hydrophobicity of sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

2.6 ROO·对肌浆蛋白粒度的影响

不同浓度AAPH处理的兔肉肌浆蛋白粒度分布如图6所示，所有肌浆蛋白样品粒度主要分布在200～2 000 nm之间。未氧化的肌浆蛋白粒度较小，随着AAPH浓度的增大，肌浆蛋白粒度逐渐增大。Bao Zhijie等[12]报道了AAPH可以引起卵清蛋白粒度的增大，这与本研究的结果一致。蛋白质粒度可以比较直观地反映蛋白质的聚集。粒度越大，蛋白质聚集程度越高。综上，本研究结果表明ROO·可以引起肌浆蛋白聚集程度的增大。蛋白质粒度的增大是分子间通过二硫键和疏水相互作用等作用力产生聚集体引起的[38]。

图6 AAPH处理对肌浆蛋白粒度的影响Fig. 6 Changes in particle size of sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

2.7 ROO·对肌浆蛋白溶液浊度的影响

不同浓度AAPH处理的兔肉肌浆蛋白浊度变化情况如图7所示，随着AAPH浓度的增大，肌浆蛋白浊度呈现不断增大的趋势。在AAPH浓度为5 mmol/L时，肌浆蛋白浊度约为对照组浊度的1.5 倍。蛋白质浊度可以反映蛋白质的聚集程度。浊度增大主要是由溶液中聚集体的质量和尺寸变化引起的[15]。肌浆蛋白溶液浊度增大说明ROO·可以导致肌浆蛋白溶液中形成较大的蛋白质聚集体，这与2.6节粒度分析得出的结论一致。Cui Xuhai等[39]报道了羟自由基可以引起乳清蛋白浊度的增大，这与本研究的结论类似。结合前文中总巯基含量变化结果以及SDS-PAGE的蛋白变化结果分析，不难发现，随着AAPH浓度的升高，通过二硫键形成的聚集体数量逐渐增多，这是本研究中肌浆蛋白聚集体形成的主要原因。

图7 AAPH处理对肌浆蛋白溶液浊度的影响Fig. 7 Changes in turbidity of sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

2.8 过氧自由基对肌浆蛋白溶解度的影响

不同浓度AAPH处理的兔肉肌浆蛋白溶解度变化如图8所示，当AAPH浓度为0～2 mmol/L时，肌浆蛋白溶解度变化不显著（P＞0.05），而当AAPH浓度为3～5 mmol/L时，肌浆蛋白溶解度随AAPH浓度增大显著减小（P＜0.05）。蛋白质溶解度下降可能与肌浆蛋白聚集行为引起的不稳定性有关[40]。Berardo等[41]报道了氧化可以引起肌浆蛋白溶解度的下降。巯基氧化后形成二硫键交联，这会引起蛋白质聚集，继而导致蛋白质溶解度下降[42]。Li Chengliang等[43]报道了辐照处理可以引起猪肉肌浆蛋白溶解度的降低，并且认为这是由氧化修饰后肌浆蛋白的交联以及肌浆蛋白无序分子结构的出现引起的。综上，本研究中肌浆蛋白聚集体的生成是引起蛋白质溶解度下降的主要原因之一。Mohan等[40]指出氨基酸残基的平均疏水性和电荷频率是决定蛋白溶解度的两个重要因素：平均疏水性越低，电荷频率越高，蛋白溶解度越高。蛋白质溶解度可以反映蛋白质变性情况，其从根本上与蛋白质的疏水性/亲水性平衡有关。本研究中，ROO·引起肌浆蛋白表面疏水性的增大，这使得肌浆蛋白分子间疏水相互作用增强，从而形成蛋白质聚集体，导致溶解度下降。

图8 AAPH处理对肌浆蛋白溶解度的影响Fig. 8 Changes in solubility of sarcoplasmic proteins treated with different concentrations of AAPH

2.9 肌浆蛋白聚集机制分析结果

过氧自由基诱导肌浆蛋白聚集机制如图9所示。在肌肉组织中，脂质诱导氧化体系和肌红蛋白诱导氧化体系是主要的活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成体系。ROO·是脂质诱导氧化体系中重要的ROS，可以直接引发肌浆蛋白的氧化（羰基化、巯基损耗和二硫键交联）。同时，ROO·可以促进肌红蛋白的氧化，引起高价肌红蛋白（四价）的积累，Mb(IV)＝O可以从蛋白质分子中提取氢原子并引发蛋白质氧化。因此，ROO·不仅可以直接引起肌浆蛋白的氧化，还可以通过影响肌红蛋白诱导氧化体系来促进肌浆蛋白氧化。ROO·直接或通过介导肌红蛋白诱导氧化体系引发的蛋白质二硫键生成是蛋白质交联的重要作用力。

图9 过氧自由基诱导肌浆蛋白聚集机制Fig. 9 Aggregation mechanism of sarcoplasmic proteins induced by lipid peroxyl radicals

巯基与弱二级键有关，有助于稳定蛋白质的三级结构[38]。作为蛋白质中最为活跃的位点，巯基优先受到脂质诱导氧化体系和肌红蛋白诱导氧化体系的ROS攻击，引起蛋白质三级结构的变化，继而引发蛋白质的去折叠。伴随着蛋白质的去折叠，蛋白质内部疏水基团暴露，蛋白质疏水相互作用增强。疏水相互作用是引发蛋白质交联聚集的另一主要作用力。

事实上，蛋白质结构的变化也会影响其巯基的氧化。蛋白质三级结构的空间位阻效应可以阻止ROS进入蛋白质分子内部攻击敏感氨基酸残基。当蛋白质发生去折叠时，位于内部的巯基基团更容易接触到自由基，继而发生氧化反应。此外，在蛋白质去折叠过程中，两个半胱氨酸残基的巯基距离接近时，就可能发生氧化反应，形成二硫键交联[44]。因此，ROO·引起的肌浆蛋白结构变化不仅可以直接通过疏水相互作用对蛋白质聚集产生影响，还可以通过影响二硫键的交联对蛋白质聚集产生作用。

除二硫键和疏水相互作用外，一些其他的共价键（色氨酸-色氨酸、酪氨酸-酪氨酸、色氨酸-酪氨酸）也是引起蛋白质交联聚集的重要作用力。但在本研究中，SDS-PAGE结果比较直观地反映出这些共价键并未参与肌浆蛋白的交联聚集。由此可知，二硫键交联和疏水相互作用是引发肌浆蛋白交联聚集的主要作用力。

3 结 论

本实验利用AAPH的热分解作用生成ROO·，研究了ROO·胁迫兔肉肌浆蛋白氧化聚集机制。作为脂质诱导氧化体系的重要自由基物质，ROO·可以直接引起肌浆蛋白的氧化修饰。此外，ROO·也可以通过影响肌红蛋白诱导氧化体系引发Mb(IV)＝O等ROS的积累。ROO·的直接作用和间接作用（影响肌红蛋白诱导氧化体系）共同导致蛋白质羰基化、巯基损失和蛋白质二硫键交联生成，同时还可以引起肌浆蛋白的去折叠和疏水基团的暴露。蛋白质二硫键交联和疏水相互作用是引起肌浆蛋白聚集的主要作用力。