水产品中冰晶重结晶机理及控制方法的研究进展

谭明堂，王金锋，谢 晶,4,

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.上海冷链装备性能与节能评价专业技术服务平台，上海 201306；4.食品科学与工程国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306）

冷冻由于能够延长水产品货架期且维持其高品质，在很早之前就已用于水产品的贮藏保鲜。根据农业农村部渔业渔政局数据显示，2019年中国水产品总产量达到6 480.36万 t，其中冷冻水产品总量达到1 532.27万 t[1]。在冷冻过程中，水产品中的部分水由于相变而转变成冰晶[2]。冻结水含量主要取决于冷冻温度和产品本身的成分[3]。然而，在冷冻过程中，形成的冰晶会严重影响水产品细胞的完整性，从而导致其品质的下降[4]。众所周知，冰晶的大小、形态和分布与冷冻速率息息相关[5-6]。另外，冷冻水产品在冷冻、冻藏、运输和冻融过程中都有可能发生冰晶的重结晶[7]，而冰晶重结晶会改变水产品中冰晶的大小及分布[8]。温度的波动会促使冰晶发生溶解再结晶，加剧对产品品质的影响[9-10]。因此，如何控制冰晶的重结晶、抑制冰晶的生长、延缓水产品品质的下降是冷冻保鲜的重点研究方向之一。

目前，添加抗冻剂是缓解冰晶重结晶的重要方法。最常用的抗冻剂有二甲基亚砜[11]、甘油[12]、1,2-丙二醇[13]和具有冰重结晶抑制（ice recrystallization inhibition，IRI）活性的聚合物，比如聚乙烯醇和聚乙二醇[14]等。但是，在食品中使用这些抗冻剂时就必须评估其可能的安全风险[13]。近年来，糖类物质作为抗冻剂已被广泛应用于冷冻水产品的加工中[15]。而且抗冻蛋白（antifreeze proteins，AFPs）作为从天然环境中提取的活性蛋白，其能够依附在冰晶上，从而抑制冰晶的重结晶。目前国内外针对水产品中冰晶重结晶的研究缺乏系统性的概括和分析。因此，本文总结了近年来在此领域的最新研究进展，综述了水产品中冰晶重结晶的机理及其控制方法，以期为研发抑制水产品中冰晶重结晶的方法，维持冷冻产品的高品质提供理论依据。

1 冰晶重结晶的机制

冰晶形成之后，任何冰晶体的形状、大小、数量或者其他变化过程均可称为冰晶重结晶[16]。重结晶的表现为小冰晶聚集形成大冰晶、晶体的平均尺寸增加、晶核数减少、晶体的总表面自由能降低[17]。驱动水产品中冰晶重结晶主要有3 种机制：积聚、迁移和表面等渗[18]，具体见图1。积聚主要发生在重结晶的早期阶段，相邻区域的晶体容易融合形成较大的晶体[4]。迁移性重结晶也被称为奥斯特瓦尔德熟化，在温度变化影响下，小冰晶先融化且产生的液体迁移到大冰晶表面，最终导致小冰晶的消失、大冰晶的生长。目前已知影响迁移性重结晶的因素主要有温度和水的扩散率[17]。冷冻温度越低，水分子的迁移速度越慢，水分子越难聚集在大冰晶上[4]。在表面等渗重结晶过程中，晶体系统趋向于热力学稳定状态，粗糙表面的晶体在变得光滑后又会趋向于锐利形态[16]。

图1 冰晶重结晶的3 种机制（积聚、迁移和表面等渗）[4]Fig. 1 Three mechanisms of ice recrystallization (accretion, migration,and surface isomass)[4]

2 重结晶对水产品品质的影响

在冻藏和运输过程中往往会出现温度波动。温度波动会导致冰晶的尺寸、分布和形状发生改变，从而加大对水产品的机械损伤，降低其品质。有研究表明，温度波动（－18～4 ℃和－18～－80 ℃）均会导致形成更大的冰晶（表面积增加）和不规则的冰晶（圆度降低），加剧肌纤维断裂，对虾仁的肌肉组织造成不可逆的机械损伤，且在相同波动次数情况下，－18～4 ℃比－18～－80 ℃对样品造成的损伤更大[9,19]。温度波动也会影响鲶鱼鱼片的解冻损失、脂肪水解和氧化[10]。

在冷冻过程中水会从肌纤维内部往外部迁移，最后形成的大冰晶对肌纤维的损伤较大，影响解冻后肌纤维对水的重吸收能力[20]。虾仁在经历温度波动后，其持水能力明显降低，这可能与冰晶对肌纤维的破坏和蛋白质变性有关[9]。此外，由冻融循环引起的温度波动对肌纤维的保水能力和表面疏水性影响更大[21]。在冻融循环过程中，冰晶会反复融化和形成，这大大增加了冰晶对罗非鱼肌纤维的机械损伤，大大削弱其持水能力[22]。因此，为了延缓水产品水分的流失和质量的降低，应控制温度波动对水产品重结晶的影响。此外，与小冰晶相比，样品中的大冰晶对水蒸气流动的抵抗力较小，表面水分蒸发后会留下较大的孔，易促进在冻藏期间样品与外界环境的传热、传质，增强水产品的干耗[23]，因此需特别注意在冻藏过程中冰晶的重结晶对水产品干耗的影响。

温度波动除了对水产品的汁液损失影响较大外，也会促进蛋白质和脂质的氧化[24]。这可能是由于在冻藏期间温度波动会导致冰晶长大，加剧对肌肉细胞的破坏，导致线粒体、溶酶体酶、血红素铁等其他促氧化剂的释放，促进蛋白质和脂质的氧化反应[25]。冰晶对肌肉组织的破坏同样也会影响蛋白质的结构和含量[19]。

水产品的质构和颜色是影响消费者评价品质最直观的因素。有研究表明，与内源蛋白水解酶活性和蛋白质、脂肪氧化相比，冰晶对冷冻贮藏过程中的鱼类质构的劣变影响最大，这种劣变主要发生在冻藏前期[26]。另外，温度的波动使冰晶尺寸变大，加剧质构方面的劣变，这可能是由于大冰晶的机械损伤导致水产品结缔组织的机械强度降低、水分流失和蛋白质聚集[19]。随着冷冻三文鱼表层冰晶尺寸的增大，其L*值减小，a*和b*值增大，产品表面呈现较深的颜色[27]。因此，为防止冰晶重结晶对水产品品质产生负面影响，应尽量避免冷冻、运输和冻藏过程中的温度波动。

3 冰晶重结晶抑制剂

为了抑制冰晶重结晶对水产品质量产生的不利影响，除了控制冻品温度的升高和温度波动外，目前倾向于往水产品中加入冰重结晶抑制剂，例如糖类、AFPs、抗冻肽和具有IRI活性的聚合物等。

3.1 糖类

糖类物质作为一种抑制冰晶重结晶物质，目前已被广泛应用于冷冻水产品中。Zhang Mingke等[28]研究了4 种二糖（蔗糖、海藻糖、麦芽糖和乳糖）对浓甘油水溶液冰晶成核和生长的影响，结果发现蔗糖在抑制冰晶成核和生长上的效果最佳。但是，Klinmalai等[29]却发现相较于蔗糖，海藻糖的过冷度更高，生成的冰晶更细小，且因水迁移率低，有更低的冰晶重结晶速率。目前社会追求的是低糖、低热的消费趋势[30]。因此，研究人员在运用糖类抑制水产品的冰晶重结晶时，更倾向于选择低甜度的糖类。

与 磷酸盐Na4P2O7相比，用低甜度和低热量的海藻糖和藻酸盐低聚糖浸泡能够更好地抑制在温度波动时虾仁中冰晶的生长和重结晶，这对于改善虾仁的持水能力，减缓冷冻诱导的蛋白质变性，降低冰晶对虾肌肉组织的损害十分有利[9]。研究人员分别对k-角叉菜胶和l-角叉菜胶的IRI活性和热滞（thermal hysteresis，TH）活性（熔点和凝固点之间的温度差）进行测试，结果显示这两种糖类都具有IRI活性且k-角叉菜胶的IRI活性比l-角叉菜胶更高，但都不具有TH活性[31]。Zhang Bin等[19]分别k-角叉菜寡糖和木寡糖浸泡过虾仁，发现这两种糖都具有比Na4P2O7更好的抑制冷冻去皮虾冰晶重结晶的能力。由于k-角叉菜胶分子本身容易聚集在一起具有凝胶特性而降低了对冰重结晶的抑制能力。通常盐的加入可促进k-角叉菜胶分子凝胶化，但是NaI的加入可防止k-角叉菜胶分子聚集在一起，对IRI活性没有影响[32]。关于糖类物质对于冰生长机制的研究，Zhang Bin等[25,33]认为糖分子通过氢键、疏水或静电的相互作用与冰晶结合会影响肌肉蛋白质周围水分子的分布及其迁移，从而降低冰晶重结晶发生的概率。糖类对于冰晶的作用机制目前仅通过分子动力学模拟，还缺少实验的支撑。

糖醇一般由糖类制备，含有两个以上的羟基，已被作为冰重结晶抑制剂用于冷冻水产品的加工。在虾仁冻藏过程中，冰晶仍在不断生长，而添加木糖醇、异麦芽糖醇及甘露糖醇后可有效抑制其冰晶的重结晶，这可能是因为糖醇分子中的羟基通过束缚其周围水分子，减缓冰晶生长速率，抑制冰重结晶，降低对组织的机械损伤[34]。同样，甘露醇和木糖醇对南美白对虾的冰晶生长也有较好的抑制作用[35]。山梨糖醇中的羟基可通过氢键与水相结合，抑制水产品中冰晶的生成，起到较好的抑制冰重结晶作用[36]。此外，糖类分子中羟基数目越多，抑制冰晶重结晶的效果越好[15]。为了更好地抑制冰晶重结晶，还可以将糖类与其他抗冻剂结合使用。与淡水处理组相比，木糖醇、壳聚糖、海藻酸钠、氯化钠和三聚磷酸钠的复配溶液可以更好地抑制小龙虾的冰晶形成和生长，并且在复配液浸泡小龙虾时使用超声处理能够更好地维持样品的品质[37]。Solocinski等[11]研究了海藻糖和二甲基亚砜（Me2SO）溶液对冰晶生成、细胞活力和代谢的影响，结果显示二甲基亚砜可以进入细胞内对细胞内冰晶发挥作用，而海藻糖由于无法进入细胞内仅对细胞外冰晶的生成发挥作用，因此这两者抗冻剂的结合能够同时对细胞内外的冰晶起到抑制作用。这可为未来抑制水产品冰晶重结晶提供新思路。关于糖类对于冰晶重结晶抑制的理论仍停留在假设阶段，未来需进一步深入探索。

3.2 抗冻蛋白

最早对AFPs的研究可追溯至1969年，从南极鱼体内发现存在AFPs物质，其能防止体液冻结[38]。AFPs通过结合到冰晶表面来降低冰晶的凝固点，抑制冰晶生长[39]。AFPs除了具有TH活性，抑制冰晶形成外，还具有IRI活性，起到抑制冰晶重结晶的作用[40]。通常，AFPs的IRI活性越高，可以形成的冰晶越小[38]。虽然，AFPs的IRI和TH能力是通过吸附在冰晶表面表现出抗冻性和避免冷冻，但是同一物种中IRI和TH之间似乎并没有明显的相关性[41]。

目前AFPs在抑制水产品的冰晶重结晶方面已有研究。AFPs也被称为冰结构蛋白（ice structuring proteins，ISPs）或冰结合蛋白（ice binding proteins，IBPs）[15]。ISPs可以起到抑制冰晶长大、改变冰晶形态、抑制重结晶发生、维持细胞完整性并减少组织损伤、提高冻融过程鲤鱼肌原纤维蛋白结构稳定性的作用[42]。同时，ISPs还可以有效地抑制鲤鱼在冻融循环周期的水分迁移和因冰晶重结晶对其微结构破坏和蛋白质、脂质氧化[43]。Nian Linyu等[44]从鲱鱼体内提取得到的AFPs通过与冰晶结合来降低冰点，从而抑制冰晶的形成，并且可以抑制因冻融循环引起的重结晶以保护大嘴鲈鱼免受冰晶损伤，维持产品的品质。由于AFPs溶液的分散性差，壳聚糖磁性纳米粒子的加入可以改善系统的稳定性和均匀性[45]。鲱鱼AFPs和壳聚糖磁性纳米粒子通过真空浸渍结合可以抑制红鲷鱼的冰晶生长，以及有助于抑制其蛋白质氧化和聚集[46]。生物体的AFPs抗冻活性容易受到环境的影响，比如温度、季节和昼夜节律等[38]。为了增强AFPs的IRI活性，可以通过控制AFPs与冰晶之间的吸附性实现。在冷冻保存过程中，添加钠盐可以增强AFPs的IRI活性[47]。化学阳离子修饰的AFP III可以提高其热稳定性，增强在高温下的抗变性能力，同时与天然AFP III相比，不会影响其IRI活性[48]。虽然AFPs具有极佳的IRI活性，但是由于AFPs在提取、纯化和合成等相关高成本的限制，在工业生产中很难像糖类一样大规模运用。

3.3 抗冻肽

AFPs的提取主要来源于在高寒、高海拔等极端环境下的生物体，比如鱼、昆虫、细菌和植物等。而抗冻肽的制备主要是通过蛋白酶解从食源性蛋白源获得[7]。抗冻肽能够解决天然AFPs存在的大规模纯化等问题。抗冻肽具有类似AFPs的作用，能够在极低浓度下有效抑制冰重结晶的能力[49]。比如利用碱性蛋白酶从猪胶原蛋白提取的抗冻肽具有TH活性，能够改善冰淇淋的重结晶[50]。虽然鸡胶原蛋白肽的冰晶抑制能力不如I型AFP，但是其仍然具有良好的低温保护活性，这可为抑制水产品冰晶方法提供一个选项。蔗糖溶液经历温度波动（－16～－12 ℃）后，添加质量浓度为1 mg/mL的鸡胶原蛋白肽可使冰晶大小降低70%[51]。虽然抗冻肽已用于抑制食品中冰晶的重结晶，例如樱桃[52]、冷冻面团[53]和冰淇凌[54]等，但是在冷冻水产品方面的文献较少。李晓坤[55]在鱼糜中添加了不同量的抗冻肽（2%、4%、8%，以鱼糜质量计，下同）和8%商业抗冻剂，结果发现抗冻肽能够有效抑制蛋白质的冷冻变性、冰晶的生长，且低温保护效果由高到低为：8%抗冻肽＞4%抗冻肽＞8%商业抗冻剂＞2%抗冻肽，添加量越高，对冰晶的抑制越好，但是选择添加量时应同时考虑效能和经济性。未来需要进一步探索抗冻肽在抑制水产品重结晶方面的应用，为其广泛应用提供理论研究依据。

3.4 具有IRI的聚合物

除了糖类和AFPs有IRI活性，一些聚合物也能够抑制冰晶重结晶。聚合物的IRI活性虽然远不如天然抗冻剂，但是它的活性可以满足冷冻保存的效果，且由于价廉易得而显得更加重要[56]。众所周知，聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）是一种水溶性合成聚合物，它的合成仿制AFPs的作用原理，可以有效抑制冰的重结晶[57]。研究人员通过分子动力学模拟研究发现，PVA上的羟基通过与水分子上的氢键相连而结合到冰晶表面[58]。同时PVA还会降低水分子之间的氢键数，导致体系中游离水的减少，成核温度和结晶潜热降低，从而抑制冰晶的结晶[59]。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）与PVA类似，也具有IRI活性，能够抑制冰晶的重结晶[56]。此外，Mitchell等[14]发现聚合物PVA和PEG混合使用后的IRI活性更高。

纳米纤维素依据微观形态的不同分为纤维素纳米微纤丝（cellulose nanofibrils，CNFs）和纤维素纳米微晶（cellulose nanocrystals，CNCs）[60]。由于纳米纤维素具有生物降解性、低密度、高表面积和柔韧性而广受关注，被广泛用于增强剂、乳液稳定剂、阻隔膜和黏合剂等方面[61]。在2019年，Li Teng等[62]首次发现纳米纤维素具有IRI活性。在0.01 mol/L NaCl和磷酸缓盐冲液中加入纳米纤维素后，发现其起到了抑制冰晶生长的作用，同时与对照组（PEG）相比，在纳米纤维素中观察到较小的冰晶，这表明所用的CNFs和CNCs都具有IRI活性。但是Velásquez-Cock等[63]却发现CNFs对冰淇淋冰晶的生长没影响，这可能是因为CNFs的制备方法有差异。为了增强纳米纤维素的IRI活性，需对纳米纤维素的两个最重要的结构参数——表面电荷密度（surface charge density，SCD）和原纤维长度进行研究。当CNCs的原纤维不聚集时，通过降低其SCD使IRI活性增加，SCD较低的CNF也具有较高的IRI活性，且通过降低pH值使得CNFs的羧酸根质子化也可增强其IRI活性[64]。超声处理可以降低原纤维的聚集和长度，在超声30 min内主要破坏原纤维的聚集而使得IRI活性增强，而更长的超声处理时间会缩短原纤维的长度，导致IRI活性降低[65]。Zhou Ting等[66]发现PVA/CNFs气凝胶具有良好的隔热性能和低密度，未来可将其制备成膜包裹在水产品表面，减缓因冻藏过程中出现的短暂温度波动对水产品冰晶重结晶的影响。虽然PVA和纳米纤维素都已证实具有IRI活性，但是以何种方式应用于冷冻水产品冰晶重结晶的抑制需深入探索。

3.5 其他重结晶抑制剂

甘油又名丙三醇，具有两个一级羟基和一个二级羟基，是最简单的三元醇，可与水完全混溶，其可起到抑制冰晶生长的作用[12]。但是，甘油用在抑制水产品冰晶生长中需要高浓度，这会增加毒性，同时也可能对产品的外观和气味造成影响。最近有研究表明氧化石墨烯是一种高IRI活性和低TH活性的材料，能很好地抑制冰晶的生长和重结晶，且在抑制马精子的冰晶生长时效果比甘油好，但不如PVA和AFPs[67]。氧化石墨烯会优先吸附在冰晶表面，由于吉布斯-汤普森效应，其通过使冰晶表面发生弯曲，从而抑制冰晶的生长[68]。但是氧化石墨烯还未发现在食品研究领域有报道，需要关注氧化石墨烯的使用是否会对水产品有其他影响。

4 结 语

冷冻水产品在冻结、运输和冻藏过程中无法避免冰晶重结晶的发生。而重结晶会导致冰晶形态改变，对水产品的肌纤维造成不可逆的机械损伤，导致汁液流失加快，蛋白质和脂质氧化以及水产品质构、表面颜色等品质的劣化等。目前重结晶对水产品品质的影响仅简单归结于冰晶大小和形态，应该深入探索各个品质指标与冰晶的变化是否直接相关。添加冰重结晶抑制剂是解决冰重结晶对水产品品质影响的有效途径。糖类物质已被广泛运用于水产品的冰晶重结晶中，目前对于其作用机理仅通过分子动力学来分析，还缺少实验的验证。AFPs由于其提纯的高成本目前无法广泛应用，而抗冻肽具有AFPs类似的功能且可通过酶切法大量获得。未来应对抗冻肽在水产品中的应用需进一步探索。根据AFPs对冰晶抑制的机理，已发现了众多具有IRI活性的聚合物，但是目前在抑制水产品冰晶重结晶方面的报道较少。另外，还应关注聚合物在用于水产品后的残留是否有安全问题。对水产品中冰晶重结晶的机理及控制方法的综述，不仅有助于人们对冰晶重结晶最新现状的了解，还能够为提升冷冻水产品质量提供参考意见。