四妙勇安汤“异病同治”动脉粥样硬化与血栓闭塞性脉管炎机制研究

李艺博　张悦健　李娟　童宏选　卢涛

摘要 目的：通过生物信息分析手段探讨四妙勇安汤对动脉粥样硬化（AS）与血栓闭塞性脉管炎（TAO）“异病同治”的潜在分子机制。方法：通过数据库挖掘与检索获取四妙勇安汤中4味中药的活性化合物和对应的靶标;通过GeneCards、比较基因组数据库（CTD）以及美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库筛选AS和TAO的关联靶点;运用Venny 2.1，获得药物作用于二病的共有靶点;基于STRING数据库构建共有靶蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;通过Cytoscape 3.7.2软件构建药物-活性化合物-共有靶点-疾病整体调控网络图。使用Bioconductor生物信息软件包进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果：四妙勇安汤与AS、TAO的共有靶点主要为VEGFA、IL6、JUN、TNF、FOS、MAPK8、MMP9、IL10、ICAM1等计47个;筛选出以黄酮类和甾醇类为主的有效活性成分计9个;KEGG通路富集得到的这些靶点共同参与糖尿病并发症AGE-RAGE、TNF、动脉粥样硬化与流体剪切应力、人巨细胞病毒感染、細胞凋亡、T细胞受体等多条通路调节。结论：四妙勇安汤通过抗炎、减少斑块形成、免疫反应、改变血液流变等多条生物学通路发挥药理作用，证实了其多成分、多靶点、多途径的调节特点，预测了四妙勇安汤“异病同治”AS与TAO的潜在分子机制，为实验设计和后续研究提供理论依据。

关键词 四妙勇安汤;动脉粥样硬化;血栓闭塞性脉管炎;异病同治;潜在作用机制;网络药理学

Abstract Objective：To explore the the common key target and signaling pathway of Simiao Yong′an（SMYA） Decoction in treating atherosclerosis and thromboangiitis obliterans by bioinformatic analysis.Methods：The active compounds and corresponding targets of 4 traditional Chinese medicines from SMYA Decoction were obtained by database mining and retrieval.The associated targets of AS and TAO were screened by GeneCards，CTD and NCBI database.Venny 2.1 was used to obtain the common targets of the two diseases of drug action.The PPI network of common target proteins was constructed through STRING database.Cytoscape 3.7.2 software was used to construct drug-active compound-common target-disease global regulatory network diagrams.The GO classified enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed using Bioconductor platform.Results：The common targets of SMYA Decoction in As and Tao were mainly 47，including VEGFA，IL6，Jun，TNF，FOS，MAPK8，MMP9，IL10，ICAM1，etc.A total of 9 active components，mainly flavonoids and sterols，were screened out.These targets were enriched by KEGG pathway and participate in the regulation of multiple pathways such as AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，TNF signaling pathway，fluid shear stress and atherosclerosis，human cytomegalovirus infection，apoptosis，T cell receptor signaling pathway.Conclusion：The pharmacological effects of SMYA Decoction through anti-inflammation，reducing plaque formation and immune response，changing blood flow changes and other biological pathways have confirmed its multi-component，multi-target and multi-pathway regulatory characteristics.Simultaneously，the study has predicted the potential molecular mechanism for the “same treatment for different diseases” of AS and TAO，and provided theoretical basis for experimental design and further research in traditional Chinese medicine.

Keywords Simiao Yong′an（SMYA） Decoction; Atherosclerosis; Thromboangiitis obliterans; Treating different diseases with same method; Potential mechanism of action; Network pharmacology

中圖分类号：R285.6;R543.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.002

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种危害人类健康的慢性心血管疾病，是老年人最常见的死亡原因之一，占心血管疾病死亡总人数的3/4[1-2]。其主要病变是大中动脉血管内壁脂质沉积，伴平滑肌细胞和纤维基质增生，并逐渐发展为成片的粥样硬化斑块，导致动脉管腔狭窄、破裂出血，甚至引发急性心血管疾病，炎症在AS斑块的发生和发展过程中起着重要的作用[3]。在治疗方面，临床主要聚焦抗炎、调节血脂、抗氧化、溶栓等方面，但这些治疗具有一定的局限性和不良反应[4]。根据其病理变化和临床特征，归属于中医学“痰证、瘀证、胸痹、真心痛”等范畴，病机主要为脏腑功能紊乱、气血津液失调，导致气滞、血瘀、寒凝、痰湿等病理现象[5]。血栓闭塞性脉管炎（Thromboangiitis Obliterans，TAO）为血管壁节段性、非化脓性炎症反应伴腔内血栓形成，管腔阻塞引起肢体缺血而产生疼痛、间歇性跛行、足背动脉减弱等，严重者出现肢端溃疡、坏死，甚至致残，属于中医“脱疽”的范畴，病机为气血凝滞、经脉阻塞[6-7]。TAO的病因和发病机制尚不清楚，临床主要以抗血小板、扩张血管药物和手术治疗为主要手段[8];但药物作用单一，手术存在差异性大、价格昂贵等问题，不能从根本上延缓或控制疾病的发生发展[9]。中医药不良反应小，多组分、多靶点的治疗特点在近几年越来越受到大众的关注，成为研究的热点。

四妙勇安汤最早出现在《华佗神医秘传》，由金银花、玄参、当归、甘草4味药组成[10]。根据辨证论治思维，AS与TAO虽然临床表现和发病部位均不相同，但病机相似，病理上均与热毒蕴结、气血瘀滞、阴液耗伤相关，可用通络活血、益气养阴、化痰祛瘀、清热解毒法治之。四妙勇安汤功效滋阴活血解毒，是著名的外科脱疽方，临床研究已证明可用于AS、TAO的疾病治疗[11]，符合中医“异病同治”的理论思想。此外，现代药理研究表明其具有抗炎、调节血脂、抗凝、抑制血栓形成、改善血液流变学、保护血管内皮细胞等作用[12-16]。这可能是其“异病同治”的研究基础。

异病同治最早出自《黄帝内经》，指不同的疾病，在其发展过程中，由于辨证出现了相同的病机，因而采用同一方法治疗的法则，均可获得理想的治疗效果[17]。从古至今，“异病同治”法在指导中医临床诊疗上发挥着重要作用，但其内在机制仍有待探索。网络药理学研究属于生物信息分析的手段之一，是近年兴起的药物研究新途径，通过构建“药物-靶点-疾病”网络，对中药的效用分子、作用靶点、通路及生物过程进行多层分析，从系统生物学和生物网络平衡的角度阐释疾病的发生发展过程，从整体观角度认识药物与机体的相互作用，符合中医药多组分、多途径、多靶点协同作用的特点[18]。因此，本研究采用网络药理学分析方法，对四妙勇安汤治疗AS与TAO进行多层面分析，初步探索其“异病同治”作用机制及规律。

1 资料与方法

1.1 四妙勇安汤活性成分收集与筛选 四妙勇安汤由金银花、当归、玄参、甘草4味中药组成。本研究依托中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）分别检索，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18为筛选条件，收集与筛选四妙勇安汤的候选活性化合物。

1.2 四妙勇安汤潜在靶点预测 通过TCMSP数据库，获取候选化合物相应的潜在靶标。运用UniProt数据库（https：//uniprot.org/），限定物种为人（Homo Sapiens），将得到的靶标标准化为基因名称（Gene Symbol）。

1.3 四妙勇安汤治疗AS、TAO的靶点获取 在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/），美国国家生物技术信息中心（NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/），比较基因组数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：//ctdbase.org/）分别键入“atherogenesis，atherosclerosis，atheroscleroses”（AS）与“thromboangitis obliterans，buerger disease，buerger′s disease”（血栓闭塞性脉管炎），选择物种为“Homo sapiens”，获取AS、TAO的疾病靶点。运用Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），将四妙勇安汤的预测靶点映射到疾病的关联靶点，以获得药物治疗AS、TAO的潜在作用靶点及共有靶点。

1.4 潜在共有靶点的蛋白质-蛋白质相互作用网络构建 将潜在共有靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/），以intersection score>0.400为筛选标准，构建共有靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）网络。

1.5 “药物-活性化合物-潜在靶点-疾病”的网络构建 将四妙勇安汤的药物、活性化合物、药物治疗的潜在靶点及疾病信息导入Cytoscape 3.7.2软件，构建四妙勇安汤异病同治AS、TAO的全链网络。

1.6 通路富集分析 运用Bioconductor软件包（http：//www.bioconductor.org/），对潜在共有靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析的生物过程分析与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并用R进行可视化处理。

2 结果

2.1 四妙勇安汤候选活性化合物的筛选及靶标预测 共检索到金银花、当归、玄参、甘草的688个化合物，根据OB≥30%、DL≥0.18，筛选获得候选活性化合物计126个，其中，金银花23个，当归2个，玄参9个，甘草92个，去掉重复项，共获得120个候选活性化合物。获得205个药物作用靶点。见表1。

2.2 四妙勇安汤治疗AS、TAO的共有靶点获取 获得AS疾病靶点5 144个，TAO疾病靶点744个。四妙勇安汤活性化合物调控的205个靶标分别与以上2个疾病靶点交集的韦恩图见图1。获得四妙勇安汤调控疾病的共有靶标47个，将其导入Cytoscape 3.7.2，构建“四妙勇安汤-共有靶标-AS-血栓闭塞性脉管炎”网络。见图2。此外，调控AS的潜在靶标184个，血栓闭塞性脉管炎49个。

2.3 共有靶标PPI网络构建及分析 将47个共有靶标导入STRING进行PPI网络分析，通过Cytoscape 3.7.2进行图像可视化。图中计47个节点，480条边。以节点示蛋白，以边表示节点间的相互作用。某点度值表征连接到该节点的边数，以此来反映节点在网络中的重要性。图示节点越大，颜色越深，表示该节点度值越大。共有靶标的平均节点度值为20.9，超过该值的靶蛋白有23个。其中，VEGFA、IL6、JUN、TNF、FOS、MAPK8、CASP3、MMP9、STAT3、EGFR、CCL2、IL10、ICAM1、SWRP1NE1、CCND1等度值显著高于其余靶点。VEGFA的节点最大，颜色最深。见图3。

2.4 “药物-活性化合物-潜在靶点-疾病”的網络构建 将四妙勇安汤的4味中药、120个活性化合物、205个靶标及映射到疾病的关联靶点（AS：184个关联靶点，TAO：49个潜在治疗靶点）导入Cytoscape 3.7.2，绘制“药物-活性化合物-潜在靶标-疾病”网络，网络共331个节点，绿色矩形表示中药，蓝色椭圆形表示活性化合物，红色六边形表示疾病，橙色箭形对应靶标。其中，未与疾病预测靶点相关联的药物靶标围绕在四妙勇安汤4味药的外周，计19个;三者的共有靶标集中在疾病外周的小圈，计47个;药物调控AS的特有靶标分布于疾病外周的大圈，计137个;调控TAO的特有靶标位于大圈之外，计2个。每条边表示中药、化合物、靶标及疾病的相互作用关系。按照度值等网络拓扑学指征进行关键化合物的筛选，发现槲皮素（Quercetin），山柰酚（kaempferol），木犀草素（Luteolin），7-甲氧基-2-甲基异黄酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone），β-谷固醇（beta-sitosterol），豆甾醇（Stigmasterol），柚皮素（naringenin），芒柄花素（formononetin），甘草查尔酮A（licochalcone A）等化合物在整个生物过程中发挥着重要作用，可能是四妙勇安汤异病同治AS、TAO的共同核心化合物。见图4。

2.5 关键共有靶点的通路分析 通过Bioconductor数据库进行GO生物过程分析及KEGG通路富集分析，获得生物过程条目计49项，P<0.01，根据P.adjust优选排名前20的GO条目，运用R软件，绘制气泡图。关键共有靶点主要集中在细胞因子受体结合（Cytokine Receptor Binding）、细胞因子活性（Cytokine Activity）、受体配体活性（Receptor Ligand Activity）、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节剂活性（Cyclin-dependent Protein Serine/Threonine Kinase Regulator Activity）、蛋白酶结合（Protease Binding）、联合蛋白结合（Integrin Binding）、生长因子受体结合（Growth Factor Receptor Binding）、R-SMAD结合（R-SMAD Binding）、蛋白激酶调节剂活性（Protein Kinase Regulator Activity）、泛素蛋白连接酶活性（Ubiquitin Protein Ligase Binding）等生物过程中。这提示四妙勇安汤通过各项生物过程的多维调控，从而异病同治AS、TAO。见图5A。

KEGG富集通路筛选得146条P<0.01的通路，将P值较小的20条通路结果以气泡图的形式呈现。这些靶点主要在糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications）、TNF信号通路（TNF Signaling Pathway）、IL-17信号通路（IL-17 Signaling Pathway）、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi Sarcoma-associated Herpesvirus Infection）、麻疹（Measles）、动脉粥样硬化与流体剪切应力（Fluid Shear Stress and

Atherosclerosis）、人巨细胞病毒感染（Human Cytomegalovirus Infection）、细胞凋亡（Apoptosis）、T细胞受体信号通路（T Cell Receptor Signaling Pathway）等富集较多。见图5B。

3 讨论

中医药是一个巨大的宝库，应当努力挖掘，加以提高。近几年，中药处方疗效显著、不良反应小的优势逐渐凸显。但其成分多样复杂，治疗靶标通路多角度的特点也为明确中药复方的作用增加了难度。网络药理学能够在基于生物信息学分析的前提下，筛选出复方组成药物的活性化合物和对应的靶标，构建“药物-活性化合物-潜在靶标-疾病”的数据网络图谱，其从宏观到微观，从整体到局部的特点为中药复方的研究提供了新思路和可行性。本研究通过网络药理学的方法，挖掘四妙勇安汤治疗AS和TAO的潜在共同作用机制，为中医治病法则之一的“异病同治”提供理论依据。

TAO中血管内皮炎症、血栓形成、阻塞后末端缺氧坏死等病理过程，同AS及其引起的心脑血管疾病等多个病理环节相似。现代研究表明，AS是一种脂质代谢异常引起的慢性炎性疾病，炎症反应始终贯穿于AS整个过程，在起始与持续阶段都有天然免疫和特异性免疫参与，抗炎成为防治AS新的干预靶点和方向[19-20]。研究报道，运用四妙勇安汤治疗TAO，能降低氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、C反应蛋白（CRP）等水平，而这些因子也同样在AS中明显升高[21]，符合中医“异病同治”的辨证论治思想。

四妙勇安汤具有清热解毒之效，兼有活血之功，但治疗AS和TAO的作用机制仍在探究中。其组成药物主要为金银花、玄参、当归、甘草。根据网络拓扑学指征进行关键化合物的筛选，发现4味药物均存在度值较高的活性化合物，可能是发挥作用的关键化合物。其中，槲皮素（Quercetin）是存在于甘草和金银花中的活性成分，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、免疫调节等功能，对氧化损伤的细胞具有保护作用，同时，能减少炎症介质（IL-1β和IL-6），增加抗炎细胞因子（IL-4、IL-10和转化生长因子-β1），通过抑制核因子κB（NF-κB）和MAPK信号通路发挥抗炎作用，对AS和TAO的炎症反应起到治疗效果[22-24]。山柰酚（Kaempferol）具有多样的生物学功效，可通过降低细胞间黏附分子的表达，防止AS的发生[25];抑制还原辅酶Ⅱ，清除脂质过氧化，抑制由这些因素引起的氧化应激而导致的AS[26];通过抑制MAPK信号通路，降低MDC、IP-10、IL-8等炎症介质的表达，阻断Tyk-STA信号通路，抑制STAT3的激活，发挥抗炎作用[27-28]。当归和玄参的活性成分β-谷甾醇（Beta-Sitosterol）在体内通过氧化过程产生的氧化产物，可破坏胆固醇胶束的形成，降低胆固醇水平，抑制胆固醇合成酶（HMG-COA）的表达，对AS起到治疗作用，同时通过提高抗炎因子IL-10、酪氨酸磷酸酶（SHP-1）的活性，抑制趋化因子、炎症介质以及NF-κB的迁移，发挥抗炎作用[29-30]。甘草总黄酮具有抗炎作用，甘草查尔酮A（Licochalcone A）是抗炎的主要成分，通过抑制炎症介质IL-1β、IL-6的释放发挥作用[31]。

共有靶标的PPI网络中，血管内皮生长因子A（VEGFA）的节点度值最大，VEGFA是促进血管新生的主要生长因子之一，调节血管内皮细胞的增殖和分化，促进内皮细胞的扩张、增殖和迁移[32-33]。但血管新生通过增加斑块的形成和血管平滑肌细胞的增殖，增高了AS的发病率[34]。研究表明，四妙勇安汤的化合物成分对血管具有双重调节作用，VEGFA作为Dll4的上游靶点激活Dll4/Notch1信号通路，精确调控血管内皮芽生、管状结构形成，使新生血管成熟并形成有效的供血网络，同时可减少丝裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、VEGFA的表达，抑制血管内斑块的新生，稳定易损斑块[35-37]。还能够通过上调丝苏氨酸蛋白激酶（p-AKT）的表达、下调p38MAPK蛋白表达，改善下肢缺血血运重建过程，促进糖尿病溃疡的愈合[38-39]。AS和TAO具有明显的炎症反应，四妙勇安汤可通过降低血清中IL-6、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-10（IL-10），以及抑制巨噬细胞分泌的细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达，发挥抗炎作用[40-42]。基质金属蛋白酶（MMPs）是一族重要的蛋白酶类，其活性和含量的升高可致细胞外基质迅速降解、纤维帽变薄，使斑块易于破裂而导致疾病发生，研究证实，四妙勇安汤的活性成分可作用于MMP-9，通過降低MMP-9的表达，升高外膜TIMP-1的表达，使新生血管的通透性降低，抑制炎症介质等进入主动脉斑块，起到稳定斑块的作用[43]。JUN、FOS均属于激活蛋白酶-1（AP-1），AP-1可刺激生长因子的转录，增加细胞的增殖和分化，化合物可通过作用于JUN和FOS，降低斑块中平滑肌细胞的含量，从而起到防治AS的作用[44]。此外，GO生物过程的关键靶点主要集中在细胞因子受体结合、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节剂活性、蛋白酶结合、生长因子受体结合、蛋白激酶调节剂活性、泛素蛋白连接酶活性等。KEGG通路富集分析结果主要涉及糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、AS与流体剪切应力、人巨细胞病毒感染、细胞凋亡、T细胞受体信号通路。其中糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路可激活NF-κB，NF-κB促进炎症介质IL-1、IL-6、TNF-α的表达，促进AS相关基因VCAM-1、VEGF、RAGE的表达[43-49];TNF信号通路参与炎症反应在内的多条信号通路，同时可促进低密度脂蛋白在血管内壁的沉积，通过活化单核巨噬细胞，产生细胞毒作用，使血管内壁增厚，管腔狭窄，血流阻力增大，加速AS和TAO的发生发展[50]。剪切力是血流在血管壁内皮表面产生的摩擦力，伴随生理剪切力的持续层流可上调内皮细胞（EC）基因和蛋白的表达，这些基因和蛋白对AS具有保护作用，低剪切力的扰动流促进动脉壁的氧化和炎症状态，导致AS发生[51-54]。

本研究通过网络药理学发现四妙勇安汤主要通过抗炎、抗氧化、免疫反应、调节血管内皮生长因子、稳定血管内斑块、改变血液流变等多成分、多靶点、多通路对AS和TAO进行干预和治疗，为中药复方临床研究提供潜在的分子作用机制。但完全依赖生物信息学技术的手段同样存在一定的局限性，基于已有的实验研究发现，金银花的主要成分绿原酸（Heriguard）和当归的主要成分阿魏酸（Ferulic Acid）均不在列表中，玄参的主要成分哈巴俄苷干（Harpagoside）对过氧化氢引起的血管内皮损伤具有一定的保护作用，但因度值较小，未被筛出[55]。

综上所述，四妙勇安汤对AS和TAO的“异病同治”是一个综合复杂的调控过程，网络药理学的应用为精确研究中药处方的作用机制提供了基于“化合物-靶标-疾病”网络的新思路，筛选得到的关键化合物、潜在共有靶点以及作用通路与AS和TAO的病因病机具有一致性，表明了预测结果的可靠性和研究价值，但同时存在筛选偏差。因此，在对中医药复方的研究中应将科技手段与实验研究相结合，进行全面、整体、综合的分析，增加中医药研究的科学内涵，为更深层次的研究提供理论依据。

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（2021-02-23收稿 责任编辑：张乐杰）