咖啡因对糖尿病小鼠肠道菌群的影响

肖 扬，魏桂枝，蒋金泉，王倩梅，尹 文，李俊杰

2型糖尿病(type 2 diabetes， T2DM)是失明、肾脏衰竭、心脏病、中风和下肢截肢的重要原因，临床上以高血糖、胰岛素抵抗和胰腺β细胞代偿失调为特征，其发病由遗传和环境因素共同引起，并且与饮食和生活方式等密切相关[1]。以往的流行病学研究表明适度的摄入咖啡(咖啡因的主要饮食来源)可以降低心血管疾病和T2DM的风险，甚至降低心血管疾病的全因死亡率[2]，但这一结论存在一些争议，有研究报道了与之相反的结果[3]。因此糖尿病和冠心病患者的饮食指南中通常不推荐咖啡，但鉴于咖啡的神经保护作用[4]，研究其对糖尿病的影响具有重要的价值。有研究表明肠道菌群的失调与代谢综合征的发展存在复杂的联系，肠道微生物组分的改变会导致肠道生化环境的不均衡、异常代谢产物的出现、炎症状态、葡萄糖代谢的改变，甚至产生胰岛素抵抗[5]。动物实验表明链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病(DM)小鼠存在肠道菌群失调，肠道中总细菌和某些菌株的比例有所降低，而利用药物或饮食恢复DM鼠肠道中乳杆菌和双歧杆菌的比例可以部分改善氧化应激和炎症状态，从而发挥一定的降糖作用[6]。Ruiz-Medina等[7]研究指出，给予高剂量咖啡因(30 mg/kg)的小鼠存在一定的生理和行为改变，而长期10 mg/(kg·d)的咖啡因可完全阻止3，4-亚甲基二氧甲基安非他明诱导的神经炎症，而不引起任何生理或行为改变。因此本研究探讨长期保守剂量咖啡因的摄入是否会改变STZ诱导的DM小鼠血糖及肠道菌群，旨在为饮食习惯对糖尿病和肠道微生物的影响提供新证据。

1 材料与方法

1.1主要仪器和试剂 咖啡因(BioVision，美国)，葡萄糖测定试剂盒-氧化酶法(上海超研生物)，STZ(北京索莱宝)，柠檬酸缓冲液(北京索莱宝)，土壤DNA抽提试剂盒(广州美基)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(广州美基)，ND-2000微量分光光度计(Thermo，美国)，CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)，引物合成(上海生工科技)。

1.2DM小鼠模型的建立 SPF级BALB/c雄性小鼠25只，体质量18～22 g，6～8周龄，购自北京华阜康，在进行实验前测定每只小鼠的血糖均在正常范围(3.9～6.0 mmol/L)。将每只小鼠单独饲养并编号(1～25)，自由进食无菌饲料和水。在(24±2)℃的恒温环境中适应性饲养1周后进行诱导造模，具体操作：小鼠禁食12 h，将STZ溶于10 mg/ml柠檬酸缓冲液(pH 4.2～4.5)后腹腔注射，连续注射3 d，第7天取尾静脉血测定空腹血糖，连续2 d血糖稳定并>11.1 mmol/L视为造模成功。

1.3DM小鼠模型血糖测定和肠道菌群测序分析

1.3.1血糖测定：造模成功小鼠继续饲养1周后，随机选取20只分为非咖啡因组和咖啡因组，每组10只。咖啡因组每天上午8点给予10 mg/kg咖啡因灌胃，非咖啡因组给予等量生理盐水灌胃。4周后用氧化酶法测定并记录2组小鼠空腹血糖。

1.3.2肠道菌群测序分析：按照“1.3.1”中的方法分组并喂养4周后取新鲜粪便样本，具体操作方法为：单手抓取并固定小鼠及其尾部，另一只手轻轻按揉小鼠下腹部，当小鼠应激性排便时，助手迅速用无菌镊子夹取粪便样本置入对应编号的无菌冻存管中，并立即保存于-80 ℃冰箱，取小鼠粪便2～3粒，并将粪便样本编组命名为咖啡因组和非咖啡因组。根据土壤DNA抽提试剂盒的说明方法，从小鼠粪便中提取总DNA，使用微量分光光度计测量DNA的浓度和纯度，利用PCR对16S rDNA的V3～V4区进行扩增。设置总反应体系为50 μl，加入1 μl的模板DNA(100 ng)，1 μl的KOD聚合酶， 5 μl的KOD Buffer和5 μl的dNTPs，加入341正向引物(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和806反向引物(5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)各1.5 μl，进行27个循环的扩增，PCR程序为：95 ℃反应2 min，98 ℃持续10 s，进行27个循环后62 ℃反应30 s，68 ℃反应30 s，最后在68 ℃下延伸10 min。利用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化扩增的PCR产物，定量采用QuantiFluorTM荧光计。等量混合纯化后的扩增产物并将测序拼头进行连接，将构建起来的文库通过Hiseq2500 PE250平台进行测序分析。得到原始测序结果后过滤掉低质量的reads并去除一些不合格的reads从而获得clean reads，通过FLASH软件(version 1.2.11)把成对clean reads组装为原始tags，利用QIIME软件(version 1.9.1)将原始tags进行过滤后得到clean tags， clean tags与参考数据库(http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)比对分析的结果用UCHIME算法进行嵌合体的去除，从而获得effective tags。使用UPARSE软件对effective tags进行序列聚类分析，将97%以上的相似性作为一个操作分类单元(OTU)。

2 结果

2.1小鼠血糖和肠道菌群的α多样性比较 对于α多样性，Chao 1、ACE指数越大，提示菌群的丰度越高；Shannon指数越大，提示菌群多样性越高；Simpson指数越大，提示菌群多样性越低。2组DM小鼠血糖、Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 2组DM小鼠血糖和肠道菌群α多样性指数比较DM为糖尿病；A为非咖啡因组，B为咖啡因组

2.2摄入咖啡因后DM小鼠肠道菌群β多样性比较 基于Jaccard距离算法分别进行了PCoA和Adnois检验。在PCoA图中各个样本的距离越近则代表各样本的物种组成越相似。本研究结果显示，2组样本出现了相互重叠，表明没有明显的聚类。见图2。此外，根据Adnois检验进行分析，结果提示，2组DM小鼠肠道菌群β多样性比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 2组DM小鼠肠道菌群基于Jaccard距离算法的PCoA图DM为糖尿病；A为非咖啡因组，B为咖啡因组

2.3不同分类学水平肠道菌群组成差异分析 本课题组分析了2组菌群在纲、目、科、属水平上肠道菌群的群落组成差异；并选取了在每个分类水平上排前10的物种进行表示，通过物种分布堆叠图的形式表示了不同分类水平2组样本的物种组成情况。见图3。在科、属水平上，咖啡因组乳杆菌的丰度明显高于非咖啡因组(P<0.05)。见表1～4。

表1 2组DM小鼠肠道菌群丰度最高的前10个纲比较

表2 2组DM小鼠肠道菌群丰度最高的前10个目比较

表3 2组小鼠肠道菌群丰度最高的前10个科比较

表4 2组小鼠肠道菌群丰度最高的前10个属比较

图3 2组DM小鼠肠道菌群在纲、目、科、属水平上的物种相对丰度DM为糖尿病；A为非咖啡因组，B为咖啡因组

3 讨论

以往研究报道，适量饮用咖啡对慢性疾病如T2DM、Alzheimers病具有保护效应[8-9]，一项包含18个队列研究的荟萃分析表明每天一杯咖啡能降低约7%患糖尿病风险[10]，但是这些研究缺乏对具体机制的探索，因此本研究拟解决两个问题,一是咖啡因的摄入对DM小鼠的血糖发挥了怎样的作用，是否具有保护效应；二是探讨咖啡因的连续摄入对DM小鼠肠道菌群丰度的影响。

本研究结果显示，连续给予咖啡因28 d后咖啡因组小鼠的血糖值有轻度下降，但与非咖啡因组比较差异无统计学意义。提示咖啡因的连续摄入对DM小鼠的血糖无明显不利影响，甚至可以轻微的降低血糖水平；因此摄入咖啡因对T2DM患者安全可行，但这与流行病学研究结果存在差异，可能的原因为研究材料和对象不同。咖啡中还含有其他的活性物质如绿原酸、多酚、类黑色素和胡洛巴碱。Hang等[9]发现长期饮用咖啡的女性体内有较高浓度胡洛巴碱，而这与较低的糖尿病风险相关联。

肠道微生物组在饮食摄入、药物代谢、维持肠道屏障和胃肠道的结构和功能及预防肠道病原体易位等方面扮演着重要角色[11]。大量证据表明，糖尿病患者的肠道环境发生了变化，其中包括紧密连接结构受损、肠道屏障破坏、肠道中葡萄糖转运蛋白受损等[12]。

本课题组高通量测序结果表明，在摄入咖啡因前后，2组DM小鼠肠道菌群的α多样性、β多样性、Shannon和Simpson指数比较差异无统计学意义；摄入咖啡因前非咖啡因组的Chao1和ACE指数低于咖啡因组，这提示咖啡因并未影响DM小鼠的菌群丰度和多样性。早期研究发现T2DM患者肠道中的拟杆菌门和厚壁菌门比例增高，并与血糖水平呈正相关[13]，而本课题组测序结果显示，咖啡因组DM小鼠肠道中拟杆菌的丰度水平较非咖啡因组下降,但差异无统计学意义。由于拟杆菌比例的增加会增强宿主肠道对单糖的摄取，促进肝脏三酰甘油的合成，导致胰岛素抵抗[14]，此外拟杆菌还可增强乳酸中琥珀酸、丙酸酯和乙酸盐的产生，继而破坏上皮细胞屏障，使病原体进入细胞[15]，因此拟杆菌丰度的下降可能有利于减轻DM小鼠肠道的炎症和胰岛素抵抗状态，但这有待进一步证实。

本研究结果显示，咖啡因组DM小鼠肠道中乳杆菌科、属的丰度明显高于非咖啡因组。一项横断面研究表明，在饮食中添加益生菌可以预防高龄和DM前期肥胖人群T2DM的发展[16]。动物实验指出给DM小鼠喂食双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌可以降低小鼠空腹和餐后血糖水平，提高葡萄糖耐量水平，这种保护效应的原因是益生菌可以促进短链脂肪酸的产生和减轻胰腺炎症[17]。乳杆菌的这种肠道菌群调节和抗炎能力同样在DM大鼠中被证实，Cabello-Olmo等[17]指出，含有乳酸菌的发酵食品可以诱导DM大鼠肠道菌群的变化，改善葡萄糖代谢，避免了T2DM的有害影响。因此，咖啡因的摄入有助于DM小鼠肠道乳杆菌属微生物的增多，这可能有助于降低DM小鼠的血糖水平。

综上所述，咖啡因的摄入可以轻微降低DM小鼠血糖，而肠道菌群物种丰度和多样性未发生改变，受咖啡因的影响，DM小鼠肠道中乳杆菌科、属丰度增加，有利于改善葡萄糖肠道代谢，减轻糖尿病症状。本研究结果对DM患者的饮食具有指导作用，在未来的研究中可改变粪便的取材部位，以及通过宏基因组测序等方法，进一步明确咖啡因发挥作用的菌种，并从其产物影响脂肪、糖代谢的角度继续探究咖啡因对DM的作用机制。